孔祥鵬，藥雅俊，李慧峰，張沙沙，祁雅慧，裴妙榮*

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，王世民國(guó)醫(yī)大師工作室，山西 晉中 030619；2.山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西 太原 030031)

梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，臨床上用于胃脘結(jié)熱或上焦客熱所致黃疸、傷寒勞復(fù)等病證的治療，療效確切[1-2]，梔子苷其代表性環(huán)烯醚萜類成分[3-5]，在治療肝膽疾病、心血管疾病、糖尿病過程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。目前，關(guān)于梔子組分大孔吸附樹脂富集工藝已有較多研究[9-11]，但在梔子上樣藥液前處理、樹脂上樣次數(shù)等方面鮮有報(bào)道，此外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室工藝的研究規(guī)模較小，導(dǎo)致上樣體積流量、洗脫體積流量等指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果誤差較大。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)梔子苷大孔吸附樹脂精制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該成分工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配置PDA檢測(cè)器、Empower數(shù)據(jù)工作站(美國(guó)Waters公司)；FA2104電子分析天平[0.1 mg，奧豪斯儀器(上海)有限公司]；AB135-S 電子分析天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；LC-4012低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；SB-5200DTDN超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；DH6-907SA烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 梔子購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院裴香萍教授鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)。梔子苷對(duì)照品購(gòu)于成都曼斯特科技有限公司(批號(hào)110749-201316，純度98%)。D101、AB-8、HPD-100、HPD-600型大孔吸附樹脂購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。甲醇(瑞典歐森巴克化學(xué)公司)、乙腈(美國(guó)Grace公司)為色譜純；乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agela Venusic C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(15∶85)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.779 mg該成分的溶液，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2 提取原液 稱取藥材適量，12倍量水煎煮提取2次，每次1 h，合并2次提取液，濃縮至0.1 g/mL，即得。

2.1.2.3 供試品溶液 精密稱取藥材精制組分0.1 g，甲醇定容至25 mL，取1 mL定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋至0.779、0.309、0.195、0.097、0.049 mg/mL，分別吸取10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程Y=27 947 126X-272 317.1(R2=0.999 7)，在0.049～0.779 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液(0.195 mg/mL)，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得梔子苷峰面積RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材精制組分適量，按“2.1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得梔子苷含量RSD為1.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得梔子苷峰面積RSD為0.86%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材精制組分6份，每份0.05 g，精密加入梔子苷含量已知的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，梔子苷加樣回收率在95%～105%之間，RSD為2.56%。

2.2 大孔吸附樹脂精制工藝優(yōu)化

2.2.1 樹脂篩選 取乙醇浸泡處理的D101、AB-8、HPD-100、HPD-600型樹脂各20 mL，裝入不同層析柱，水洗至無醇味。取“2.1.2.2”項(xiàng)下提取原液適量，繼續(xù)濃縮至1 g/mL，取40 mL上樣，水洗至澄清后用10 BV 95%乙醇洗脫。根據(jù)樹脂類型收集未吸附液、乙醇解吸附液，置于250 mL量瓶中，對(duì)應(yīng)溶劑定容至刻度，平行操作2次。

精密量取不同類型樹脂未吸附液、解吸附液各2 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?0 mL量瓶中，搖勻，濾過，得未吸附、解吸附測(cè)定液。精密量取上樣液1 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?5 mL量瓶中，濾過，得上樣測(cè)定液。分別吸取10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算吸附/解吸附量、吸附/解吸附率，公式分別為吸附量=上樣液中梔子苷總量-未吸附液中梔子苷總量、解吸附量=解吸附液中梔子苷含量、吸附率=(吸附量/上樣液中梔子苷總量)×100%、解吸附率=(解吸附量/吸附量)×100%，結(jié)果見圖1。

圖1 不同類型樹脂對(duì)梔子苷吸附、解吸附性能的影響 (n=2)

由此可知，各樹脂對(duì)梔子苷的吸附能力依次為HPD-100>AB-8>D101>HPD-600，解吸附能力依次為HPD-100>AB-8>D101>HPD-600，即HPD-100型樹脂綜合能力最優(yōu)，故以其對(duì)梔子苷進(jìn)行精制。

2.2.2 解吸附溶劑篩選 取HPD-100型樹脂5份，每份20 mL，裝入層析柱，每份上樣1 g/mL原液40 mL，水洗至澄清后，分別以 0、30%、50%、75%、95%乙醇各10 BV進(jìn)行洗脫，收集未吸附液、乙醇解吸附液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備未吸附、解吸附測(cè)定液，平行操作2次，測(cè)定解吸附量、解吸附率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)梔子苷洗脫效果的影響 (n=2)

由此可知，水洗脫可除去原液中水溶性雜質(zhì)，但過量水會(huì)導(dǎo)致梔子苷損失；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，梔子苷解吸附量、解吸附率逐漸升高，當(dāng)超過50%時(shí)兩者逐漸趨于平緩。在實(shí)際生產(chǎn)中，適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)能減少洗脫劑體積，提高洗脫及生產(chǎn)效率，綜合考慮，選擇75%乙醇作為解吸附溶劑。

2.2.3 上樣質(zhì)量濃度篩選 取“2.2.1”項(xiàng)下提取液適量，分別濃縮至0.25、0.5、0.75、1 g/mL。取HPD-100型樹脂4份，每份20 mL，裝入層析柱，上樣等量(40 g)原液，水洗至澄清，收集未吸附液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備未吸附測(cè)定液，平行操作2次，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)梔子苷未吸附量、未吸附率的影響 (n=2)

由此可知，隨著上樣質(zhì)量濃度增加，梔子苷未吸附量、未吸附率逐漸升高，而超過0.5 g/mL時(shí)兩者升高程度更明顯，故確定不高于0.5 g/mL，但上樣質(zhì)量濃度過低時(shí)又會(huì)使上樣時(shí)間延長(zhǎng)。綜合考慮，選擇0.5 g/mL作為上樣質(zhì)量濃度，即每1 mL原液相當(dāng)于生藥量0.5 g。

2.2.4 離心程度篩選 取等量原液(0.5 g/mL)適量，以梔子苷含量為指標(biāo)，采用兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，對(duì)轉(zhuǎn)速(1 000～3 000 r/min)、離心時(shí)間(5～15 min)進(jìn)行優(yōu)化。取不同轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間組合下的原液，低溫烘干，精密稱取干膏各0.1 g，甲醇定容至100 mL，精密移取1 mL，甲醇定容至25 mL量瓶中，平行操作2次，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖4。由此可知，3 000 r/min離心5 min時(shí)，梔子苷含量最高。

方差分析見表1，可知轉(zhuǎn)速對(duì)梔子苷總量有顯著影響(P<0.01)。Duncan多重比較見表2，可知隨著轉(zhuǎn)速增加，梔子苷總量逐漸升高(P<0.01)。另外，在10%顯著水平上，離心5、15 min時(shí)梔子苷總量高于10 min時(shí)，由于5、15 min時(shí)該成分總量接近，綜合考慮，確定離心程度為3 000 r/min離心5 min，與圖4一致。

圖4 離心程度對(duì)梔子苷總量的影響 (n=2)

表1 方差分析

表2 Duncan多重比較

2.2.5 上樣量篩選 取HPD-100型樹脂4份，每份20 mL，裝入層析柱，分別上樣15、20、25、30、35、40 g(0.5 g/mL，3 000 r/min離心5 min)，水洗至澄清，收集流出液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備上樣測(cè)定液，平行操作2次，測(cè)定泄漏率(流出液、上樣液中梔子苷含量比例)，結(jié)果見圖5。

圖5 上樣量對(duì)梔子苷泄漏率的影響 (n=2)

由此可知，當(dāng)上樣量在15～30 g時(shí)，泄露曲線變化平緩，泄漏率在0.5%～5%之間；超過30 g時(shí)，泄漏曲線斜率明顯升高，泄漏率超過10%，達(dá)到穿透點(diǎn)[12]。綜合考慮，選擇30 g作為上樣量，即每1 mL樹脂上樣1.5 g。

2.2.6 洗脫液收集餾分篩選 取HPD-100型樹脂180 mL，裝入層析柱，水洗至無醇味，上樣0.5 g/mL原液540 mL，水洗至澄清后，分別用1 BV純水及1 BV 10%、1 BV 30%、1 BV 50%、3 BV 75%乙醇以3 BV/h體積流量洗脫，收集餾分，回收溶劑至干，平行操作2次，精密稱取各餾分干膏0.1 g，50%甲醇定容至25 mL，取1 mL定容至10 mL，即得各洗脫餾分測(cè)定液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定梔子苷總量，結(jié)果見圖6。

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫餾分中梔子苷總量 (n=2)

由此可知，各餾分梔子苷累積量約占上樣原液中總量的84%；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，梔子苷總量呈先升后降的趨勢(shì)，其中在30%～50%洗脫液餾分中較高，但過量水洗會(huì)導(dǎo)致梔子苷損失。綜合考慮，梔子上樣水洗至澄清后以1 BV 10%、1 BV 30%、1 BV 50%、3 BV 75%乙醇洗脫，收集10%～75%洗脫液作為餾分。

2.2.7 上樣、洗脫體積流量篩選 取HPD-100型樹脂6份，每份700 mL，裝入層析柱，水洗至無醇味，取3份，分別以1、2、3 BV/h體積流量上樣0.5 g/mL原液2 000 mL，水洗至澄清，收集未吸附液，取1 mL，水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，即得未吸附測(cè)定液；另取3份樹脂，以1 BV/h體積流量上樣0.5 g/mL原液2 000 mL，水洗至澄清后，過渡至75%乙醇，分別以2、3、4 BV/h體積流量進(jìn)行洗脫，收集未吸附液、醇解吸附液，平行操作2次。取未吸附液、醇解吸附液各1 mL，水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?0 mL，即得未吸附、解吸附測(cè)定液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸附量/解吸附量、吸附率/解吸附率，結(jié)果見圖7。

圖7 不同上樣、洗脫體積流量對(duì)梔子苷吸附、解吸附性能的影響 (n=2)

由此可知，隨著上樣體積流量增加，梔子苷吸附量、吸附率緩慢降低；隨著洗脫體積流量增加，梔子苷解吸附量、解吸附率逐漸降低，在超過3 BV/h時(shí)更明顯。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，上樣、洗脫過快會(huì)使樹脂吸附、解吸附性能下降，而過慢又會(huì)增加操作時(shí)間而使效率下降，綜合考慮，分別選擇2、3 BV/h作為上樣、洗脫體積流量。

2.2.8 上樣次數(shù)篩選 取HPD-100型樹脂20 mL，裝入層析柱，水洗至無醇味，上樣0.5 g/mL原液50 mL，水洗至澄清后，過渡至75%乙醇進(jìn)行洗脫，收集未吸附液、醇解吸附液，回收溶劑至干，同法操作4次，精密稱取未吸附液干膏各0.1 g，甲醇定容至50 mL，即得未吸附測(cè)定液；精密稱取醇解吸附液干膏各0.1 g，甲醇定容至25 mL，取2 mL定容至25 mL，即得解吸附測(cè)定液，平行操作2次，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定未吸附、解吸附率，結(jié)果見圖8。

圖8 上樣次數(shù)對(duì)梔子苷吸附、解吸率的影響 (n=2)

由此可知，隨著上樣次數(shù)增加，梔子苷未吸附率逐漸升高，解吸附率逐漸降低；超過4次后，梔子苷吸附、解吸附性能明顯降低。綜合考慮，確定上樣次數(shù)不超過4次。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取HPD-100型樹脂180 mL，裝入層析柱，水洗至無醇味，以2 BV/h體積流量上樣0.5 g/mL原液540 mL，水洗至澄清后，過渡至75%乙醇，以3 BV/h體積流量洗脫至無色，收集未吸附、解吸附液。同法上樣、洗脫各3次，收集各次未吸附、解吸附液，回收溶劑至干，分別精密稱取0.1 g，甲醇定容至25 mL，取1 mL定容至10 mL，即得未吸附、解吸附測(cè)定液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸附/解吸附量、吸附/解吸附率及組分干膏中梔子苷含量，結(jié)果見圖9、表3。

圖9 梔子苷吸附/解吸附量、吸附/解吸附率 (n=3)

表3 梔子苷含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

由圖9可知，每1 mL樹脂上樣梔子生藥量1.5 g，過渡至75%乙醇洗脫至無色，梔子苷吸附、解吸附率分別為87%、91%；由表5可知，梔子苷含量約為37%，而且穩(wěn)定性理想，表明該精制工藝下梔子苷吸附、解吸附性能良好。最終確定，最優(yōu)精制工藝為每1 mL HPD-100型樹脂上樣0.5 g/mL原液3 mL(2 BV/h)，水洗至澄清，過渡至75%乙醇洗脫至無色(3 BV/h)，收集醇洗脫液，回收溶劑至干。

3 討論

大孔吸附樹脂在中藥組分富集過程中有諸多影響因素[13-15]，為提高生產(chǎn)效率，通常會(huì)對(duì)提取液濃縮，再進(jìn)行樹脂柱上樣與洗脫，但上樣原液黏稠性高，致使樹脂柱堵塞、斷流等生產(chǎn)事故頻發(fā)，而上樣液不同處理方法對(duì)效用成分大孔吸附樹脂純化效果影響也不相同[16]。關(guān)于梔子組分大孔吸附樹脂富集工藝已有較多研究[9-11]，如通過測(cè)定梔子苷吸附、解吸附率對(duì)樹脂類型、上樣量、洗脫溶劑等進(jìn)行優(yōu)化，但尚未涉及梔子上樣液前處理。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.5 g/mL梔子濃縮液3 000 r/min離心5 min時(shí)梔子苷損失最小，并降低了梔子上樣液黏稠性和樹脂柱上樣堵塞率。

在梔子組分工業(yè)化生產(chǎn)中，上樣、洗脫體積流量對(duì)效用成分吸附、解吸附性能影響較大，但由于實(shí)驗(yàn)室小試工藝所用樹脂柱體積(20 mL)過小，上樣、洗脫體積流量難以控制，導(dǎo)致其誤差較大。本實(shí)驗(yàn)在考察樹脂類型、洗脫溶劑、上樣質(zhì)量濃度、上樣量等指標(biāo)的基礎(chǔ)上，將小試工藝放大為原來的35倍，發(fā)現(xiàn)在2 BV/h上樣體積流量、3 BV/h洗脫體積流量條件下，梔子原液中梔子苷吸附、解吸附性能較好，表明該工藝工業(yè)過渡性更強(qiáng)。另外，當(dāng)大孔吸附樹脂使用次數(shù)超過4次后，梔子原液中梔子苷吸附、解吸附性能明顯降低，可為其實(shí)際生產(chǎn)提供有益參考。

在上述研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)梔子苷大孔吸附樹脂精制工藝進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相近，有效成分梔子苷含量約為37%。由此表明，HPD-100型樹脂對(duì)梔子環(huán)烯醚萜類成分富集效果良好，工藝穩(wěn)定可行，可為該成分工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)。