方 洪，韓沅沅，谷麗華*，李林楠，楊 莉，吳其國，王崢濤

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局中藥新資源與質(zhì)量評價重點實驗室，上海 201203；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203)

乙酰膽堿(ACh)是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起到重要作用，可被絲氨酸水解酶乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)水解為乙酸和膽堿，終止興奮刺激作用，保證神經(jīng)信號分子在體內(nèi)的正常傳導(dǎo)[1]。乙酰膽堿脂酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)能對乙酰膽堿脂酶進(jìn)行可逆性抑制，以減少突觸間隙乙酰膽堿的降解，達(dá)到乙酰膽堿在突觸處的積累，延長并增加乙酰膽堿的可利用性，在臨床可用于阿爾茲海默癥、重癥肌無力及青光眼的治療[2-3]。目前用于治療阿爾茨海默癥的藥物，有四種為乙酰膽堿脂酶抑制劑，如他克林、利斯的明、多奈哌齊和加蘭他敏，一定程度上對臨床癥狀有緩解作用，但也存在選擇性低、毒副作用大等不足[4]。

中藥在治療阿爾茨海默癥及新藥開發(fā)方面發(fā)揮著重要作用。近年來，很多天然產(chǎn)物被報道具有乙酰膽堿酯酶抑制作用，如石杉堿甲、加蘭他敏、石蒜堿等，在阿爾茨海默癥等疾病的治療中具有巨大的開發(fā)潛力[5]。中藥石菖蒲是天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根莖，性辛、苦、溫，歸心、胃經(jīng)，具有開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃之功，臨床上用于治療神昏癲癇，健忘失眠，耳鳴耳聾[6-7]。有學(xué)者總結(jié)中藥治療阿爾茨海默癥的用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)用于治療老年癡呆的中藥復(fù)方中石菖蒲使用頻率最高[8]。含石菖蒲的傳統(tǒng)方劑開心散、遠(yuǎn)志散和益氣聰明湯，具有治好忘，補(bǔ)益心脾、化痰開竅、益智定志的功效，現(xiàn)代研究也表明這些制劑有改善癡呆模型動物的空間學(xué)習(xí)能力和記憶再現(xiàn)能力[9-11]，與石菖蒲的傳統(tǒng)功效相一致。

高效薄層色譜 (HPTLC) 是一種分離效率高、成本低、樣品用量少、應(yīng)用廣泛的微量分析技術(shù)。薄層色譜-生物自顯影技術(shù)(thin-layer chromatography bioautography)是應(yīng)用薄層層析和生物活性檢定于一體的活性物質(zhì)篩選方法，該方法操作簡單、耗費低、靈敏度和專屬性強(qiáng)，用于膽堿酯酶抑制劑、抗氧化劑、脂肪酶抑制劑和糖苷酶抑制劑的篩選[12-15]。質(zhì)譜 (MS) 是一種靈敏度高、選擇性好、可進(jìn)行定性分析的現(xiàn)代儀器。薄層色譜-質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，可實現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，為復(fù)雜樣品中目標(biāo)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供一條有效的途徑[16]。分子對接是利用算法預(yù)測受體和配體的復(fù)合構(gòu)象及其結(jié)合親和力，近年來已被廣泛用于篩選藥物分子和驗證藥物活性[17-18]。本研究以石菖蒲為研究對象，采用薄層色譜-生物自顯影聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選和鑒定石菖蒲中抗乙酰膽堿酯酶活性成分，并結(jié)合分子對接技術(shù)，驗證和評價所篩選成分的活性效能，為石菖蒲防治阿爾茨海默癥等疾病的進(jìn)一步研究以及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 乙酰膽堿酯酶(AChE，批號1002932438)、固藍(lán)B鹽(批號1002072823)(美國Sigma 公司)；乙酸-α-萘酯(上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，批號A0037)；牛血清白蛋白(BSA，上海藍(lán)季科技發(fā)展公司，批號110913)；加蘭他敏(中國食品藥品檢定研究院，批號10050-200802)。石菖蒲產(chǎn)地云南昭通(批號2018071501)，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定為天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根莖。硅膠預(yù)制板(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所，批號20200919)；硅膠GF254預(yù)制薄層板(TLC Silica gel 60 F254，德國Merck公司，批號HX01557929)；固相萃取小柱(批號043639275A，美國Waters公司)。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher Chemical公司)；甲苯、甲醇、乙酸乙酯為分析純(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.2 儀器 薄層色譜自動點樣儀、薄層色譜成像儀、薄層色譜自動展開儀、雙槽展開缸、薄層色譜質(zhì)譜接口儀(瑞士CAMAG公司)；超聲波清洗器(美國Branson公司)；SC-15恒溫水浴槽(上海比朗儀器有限公司)；Milli-Q Synthesis A10(美國Millipore公司)；BT25S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；超高效液相色譜儀-線性離子阱質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 陽性對照溶液、試劑溶液制備 精密稱取陽性對照藥(加蘭他敏)5 mg，甲醇制成每1 mL含1 mg該成分的陽性對照溶液。取乙酰膽堿酯酶(50 U/mL)1 mL，溶于50 mL Tris-HCl 緩沖液(20 mmol/L，pH 7.8)中，加入50 mg牛血清白蛋白(BSA)[19]，制成酶溶液。精密稱取乙酸-α-萘酯75 mg，置于50 mL量瓶中，50 mL無水乙醇溶解，制成1.5 mg/mL底物溶液。精密稱取固藍(lán)B鹽50 mg，置于50 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容，制成1 mg/mL顯色劑溶液。

1.4 樣品溶液制備及揮發(fā)油提取 取藥材粉末10 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流2 h，取1 mL濾液，作為樣品溶液I；其余濾液蒸干，殘渣加2 mL水復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇活化、水平衡后的固相萃取小柱(SPE-C18，5 g)中，依次用50 mL水、10%甲醇、20%～90%甲醇、甲醇洗脫，共收集11份洗脫液，分別減壓濃縮，殘渣加1 mL洗脫液溶解，濾過，作為樣品溶液Ⅱ～Ⅻ。

按照2020年版《中國藥典》一部揮發(fā)油測定法(通則2204乙法)，取藥材粉末10 g，加入300 mL水，置于揮發(fā)油測定器中，加入二甲苯1 mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸5 h，停止加熱，放置15 min，取二甲苯層，甲醇稀釋5倍，作為揮發(fā)油溶液XⅢ。

1.5 薄層色譜分析 采用自動點樣儀，將樣品溶液I～XⅢ(5.0 μL/條帶)點于高效硅膠預(yù)制薄層板上，條帶寬度為8 mm，條帶間距為11.4 mm，置于雙槽展開缸(20 cm×10 cm)中展開，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)，展距8.5 cm，平行展開制備3份薄層板，第1塊薄層板用10%硫酸乙醇顯色后，在紫外光燈(365 nm)下檢視；第2塊用生物自顯影法顯色后進(jìn)行生物活性檢測，第3塊直接用于質(zhì)譜分析。

1.6 生物自顯影分析 根據(jù)文獻(xiàn)[19]報道的方法，并作適當(dāng)調(diào)整。將點樣展開后的薄層板浸入乙酸-α-萘酯溶液，取出，冷風(fēng)快速吹至薄層板無乙醇味，浸入乙酰膽堿酯酶溶液中，取出，置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育20 min，取出，浸入固藍(lán)B鹽溶液中，取出，觀察白色活性斑點；取陽性對照溶液，同法平行操作，將薄層板置薄層色譜成像儀上檢視、拍照。

1.7 質(zhì)譜分析 在活性條帶對應(yīng)的位置上用鉛筆在未顯色薄層板表面作好標(biāo)記，將標(biāo)記部位置于TLC-MS接口處，由UHPLC色譜儀直接洗脫并泵入電噴霧線性離子阱質(zhì)譜(LTQ-ESI-MS)儀進(jìn)行分析，洗脫劑為水-乙腈混合物(5∶95)；體積流量0.3 mL/min。質(zhì)譜儀由Xcalibur軟件控制。主要工作參數(shù)設(shè)定為離子源加熱溫度300 ℃；毛細(xì)管溫度350 ℃；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管電壓10 V；采用全掃描模式，m/z100～1 000；采集時間0.2～0.5 min。

1.8 分子對接 從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(RCSB PDB，http://www.rcsb.org/)下載人源乙酰膽堿酯酶(AChE)結(jié)構(gòu)(PDB ID為4EY6)，該蛋白原配體為乙酰膽堿酯酶抑制劑加蘭他敏[20]，選擇A鏈作為受體進(jìn)行對接，將其導(dǎo)入PyMOL軟件，進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后保存為pdb格式，再導(dǎo)入Auto Dock Tools 1.5.6[21]優(yōu)化后保存為pdbqt格式。從有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載目標(biāo)化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入Chem 3D 19.0，采用MM2力場進(jìn)行能量最小化操作后保存為mol 2格式，再導(dǎo)入Auto Dock Tools 1.5.6優(yōu)化后保存為pdbqt格式。在Auto Dock Tools 1.5.6中運行Auto Grid，以center x=-2.827，center y=-40.098，center z=30.802為中心，構(gòu)建64×64×64的盒子，采用Auto Dock Vina 1.1.2進(jìn)行對接，導(dǎo)出結(jié)合能最低的構(gòu)象，Discovery Studio 2016對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別 本實驗考察了石油醚、乙酸乙酯、甲醇、75%甲醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取率最高，白色活性斑點最清晰，故選擇其作為提取溶劑。以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)為展開劑時分離度最好，高效默克硅膠預(yù)制薄層板的質(zhì)譜信號最佳。甲醇提取溶液I的薄層圖中有3個活性條帶(Rf分別為0.57、0.45、0.23)，分別作為斑點1、2、3(圖1A)，10%硫酸乙醇顯色，在紫外燈下觀察。甲醇提取物梯度固相萃取后對成分進(jìn)行分段富集(圖1B、1C)，采用揮發(fā)油提取法提取揮發(fā)油，尋找活性成分，結(jié)果見圖1C。固相萃取共獲得11個洗脫段，活性部位主要集中在50～90%部分(Ⅶ～Ⅺ)，圖1C顯示，在50～60%有活性斑點1，同時發(fā)現(xiàn)1個新的活性斑點，記為斑點4；70%段有活性斑點2，同時發(fā)現(xiàn)活性斑點5；90%段含有活性斑點3；揮發(fā)油中含有活性斑點1、3，未發(fā)現(xiàn)新的活性斑點。

注：S為加蘭他敏。A、C分別用10%硫酸乙醇溶液顯色(365 nm)、生物自顯影試劑顯色(可見光)，B為部分分段組分的生物自顯影試劑顯色圖。圖1 石菖蒲提取液薄層色譜-生物自顯影圖譜Fig.1 TLC-bioautographic chromatograms of A. tatarinowii root extract

2.2 質(zhì)譜分析 圖2、表1顯示。斑點1在ESI+模式下m/z231.08[M+Na]+、209.17[M+H]+，二級質(zhì)譜m/z216[M+Na-15]+，結(jié)合分子質(zhì)量、與文獻(xiàn)[22]、對照品比對，鑒定為β-細(xì)辛醚；斑點2在ESI+模式下m/z277.25[M+Na]+，二級質(zhì)譜m/z259.25[M+Na]+，文獻(xiàn)中未查到相應(yīng)成分；斑點3在ESI-模式下m/z279.33[M-H]-、281.33[M+H]+，二級質(zhì)譜m/z261.33[M-H-H2O]-，結(jié)合分子質(zhì)量及與對照品對比推測為亞油酸[22]；斑點4在ESI+模式下m/z 235.25[M+H]+，二級質(zhì)譜m/z217.170 8[M+H-H2O]+，結(jié)合分子質(zhì)量及與文獻(xiàn)[23]推測為菖蒲螺酮烯；斑點5在ESI+模式下m/z241.25[M+Na]+、219.33[M+H]+，二級質(zhì)譜m/z209.08[M+Na-OCH3]+，結(jié)合分子質(zhì)量及與文獻(xiàn)[24]比對推測為桔利酮。

圖2 5個活性斑點質(zhì)譜圖及其結(jié)構(gòu)Fig.2 MS spectra and structures of five active zones

表1 5個活性斑點MS鑒定結(jié)果Tab.1 Results of MS identification of five active zones

2.3 分子對接 結(jié)合能≤-1.2 kcal/mol時小分子與蛋白可以自由結(jié)合，≤-5.0 kcal/mol時小分子與蛋白相互作用較強(qiáng)，≤-7.0 kcal/mol時視為小分子與蛋白相互作用強(qiáng)烈，結(jié)合能越低相互作用越強(qiáng)[25]。表2顯示，β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、亞油酸、桔利酮、菖蒲螺酮烯與AChE的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，表明它們與AChE相互作用均較強(qiáng)，驗證生物自顯影實驗結(jié)果，親和能力由強(qiáng)到弱依次為菖蒲螺酮烯、桔利酮、α-細(xì)辛醚、亞油酸、β細(xì)辛醚。

將表2結(jié)果導(dǎo)入Discovery Studio 2016軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖3。由此可知，AChE與各活性成分產(chǎn)生作用的重要氨基酸殘基為TRP86、TYR337、PHE338、TYR124和HIS447，其次為TYR72、GLY121、SER23、TYR341，主要表現(xiàn)為氫鍵作用和疏水作用。

表2 分子對接的結(jié)合自由能Tab.2 Binding free energy of molecular docking

圖3 活性成分與AChE受體對接模式圖Fig.3 Docking mode profiles for active constituents and AChE receptor

3 討論

石菖蒲作為一味傳統(tǒng)中藥，具有保護(hù)神經(jīng)元、提高記憶認(rèn)知功能，在臨床主要用于治療和改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病[26]。文獻(xiàn)對含量較高的β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚乙酰膽堿酯酶抑制活性多有報道，但對石菖蒲中其他成分研究較少，可能是因為其他成分含量較低，對分離、篩選及相關(guān)分析形成一定難度。本文通過高效薄層色譜-生物自顯影法對石菖蒲中乙酰膽堿酯酶抑制成分進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，發(fā)現(xiàn)甲醇提取物通過SPE固相萃取小柱后的50%～90%甲醇洗脫段富含活性成分，進(jìn)一步展開分析發(fā)現(xiàn)包括β-細(xì)辛醚在內(nèi)的5個活性斑點，通過質(zhì)譜的一級和二級碎片分析，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，其中4個活性斑點經(jīng)鑒定可能為β-細(xì)辛醚(與α-細(xì)辛醚重合)、亞油酸、桔利酮和菖蒲螺酮烯，并用β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚和亞油酸對照品驗證了鑒定結(jié)果；另一個m/z277.25[M+Na]+的活性斑點，未獲得鑒定。將5個鑒定的活性成分分子結(jié)構(gòu)與AChE蛋白進(jìn)行分子對接，以結(jié)合能低于-5.0 kcal/mol為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個活性成分均與AChE受體有較好的結(jié)合性，可能主要是通過TRP86、TRP337和PHE338等氨基酸與乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生氫鍵作用或疏水作用。

β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚是石菖蒲揮發(fā)油中的主要成分，有文獻(xiàn)報道細(xì)辛醚類是石菖蒲益智作用的藥效物質(zhì)，并認(rèn)為其作用機(jī)理可能是小分子能夠順利通過血腦屏障進(jìn)入大腦，抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力、誘導(dǎo)c-jun基因表達(dá)等改善學(xué)習(xí)記憶功能[27-28]；另有研究顯示體內(nèi)長鏈不飽和脂肪酸的缺少與AD發(fā)病有密切關(guān)系，長期適量服用長鏈不飽和脂肪酸亞油酸具有預(yù)防AD的作用，亞油酸具有乙酰膽堿酯酶活性(IC50值為18.17±1.86 mg/mL)[29-30]。β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚雖然含量高，且具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，但有報道具有急性毒性和致突變作用[31]，從而限制了臨床應(yīng)用，本次研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲中菖蒲螺酮烯和桔利酮結(jié)構(gòu)與乙酰膽堿酯酶的結(jié)合能明顯低于β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚，具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制作用，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，值得深入研究，對石菖蒲安全有效的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)具有重要意義。