汪文漪，雷 夢，劉 燦,*，馬蘭青,*

(1.北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；2.北京農(nóng)學院生物與資源環(huán)境學院，北京 102206)

對乙酰氨基酚，又稱撲熱息痛，是常見的臨床解熱鎮(zhèn)痛藥物，大量研究報道不規(guī)范服用對乙酰氨基酚可能誘發(fā)急性肝功能衰竭甚至死亡[1-2]。有研究表明，對乙酰氨基酚被肝臟代謝后產(chǎn)生會釋放大量自由基[3]，同時會導(dǎo)致肝細胞釋放各種炎癥因子引發(fā)炎癥反應(yīng)[4-5]，從而嚴重破壞肝細胞的功能[6]。

對乙酰氨基酚的研究熱點集中在肝損傷方面，多以肝細胞建立對乙酰氨基酚損傷模型[7-8]。對乙酰氨基酚經(jīng)過肝臟代謝，大部分轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)排泄出體外，其余對乙酰氨基酚(5%～10%)被細胞色素P450 2E1(CYP2E1)轉(zhuǎn)化為N-乙?；鶎Ρ锦珌啺?NAPQI)，對細胞有毒性，細胞中谷胱甘肽(GSH)可與NAPQI結(jié)合將其轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)，當谷胱甘肽耗竭后，過量的NAPQI可將細胞中蛋白質(zhì)巰基氧化或芳香化從而改變蛋白質(zhì)的功能，并破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器的功能，最終誘發(fā)肝細胞損傷甚至壞死[9]。

虎杖Polygonumcuspidatum為蓼科蓼屬多年生灌木狀草本植物[10]，具有清熱解毒的作用[11]，白藜蘆醇(resveratrol)是一種芪類化合物[12]，是虎杖中重要的活性成分，具有抗氧化[13]、抗癌[14]、抗炎[15]、保護心腦血管[6]、保肝[16]、抗纖維化[16]等多種藥理作用。

目前，對乙酰氨基酚對巨噬細胞的細胞毒性研究報道較少，本課題以小鼠巨噬細胞RAW264.7為研究載體構(gòu)建巨噬細胞損傷模型，評價對乙酰氨基酚對巨噬細胞的損傷效果，并探討白藜蘆醇在對乙酰氨基酚誘發(fā)巨噬細胞損傷中的修復(fù)作用和機制。

1 材料

1.1 細胞、試劑與藥物 RAW264.7小鼠腹腔單核巨噬白血病細胞購自北京協(xié)和細胞中心。對乙酰氨基酚(APAP)(批號D1909159)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；白藜蘆醇(貨號513F021，HPLC>98%)、MTT溶液(貨號M1025)、DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗)(貨號12100-500)、細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(貨號G3680)、活性氧檢測試劑盒(貨號CA1410)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒(貨號BC0205)、還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(貨號BC1175)均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(貨號11012-8611)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號A001-3-2)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(貨號A014-1-2)均購自南京建成生物工程研究所；總一氧化氮檢測試劑盒(貨號S0023)、細胞裂解液(貨號P0013J)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(貨號AG21017)、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(貨號AG11706)、SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混液qPCR試劑盒(貨號AG11701)均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(貨號BA00101)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號MCO-18AIC UV)；光柵型多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號xMark)；熒光倒置顯微鏡(德國ZEISS公司，型號Axio Observer A1)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號QuanStudioTM 6 Flex)；超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司，型號DW-86L628)；分光光度計(美國Unico公司，型號WFJ27200)；流式細胞儀(美國Agilent公司，型號ACEA NovoCyte D313)；高速低溫離心機(德國Eppendof公司，型號Centrifuge 5430R)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7小鼠單核巨噬細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、90% DMEM的完全培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，當細胞融合至80%～90%時進行后續(xù)處理。

2.2 細胞損傷模型構(gòu)建及藥物處理 在96孔板中加入200 μL完全培養(yǎng)基，每孔接種2×104個細胞，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度為0、50、100、200、500、1 000 μg/mL的對乙酰氨基酚，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細胞存活率，建立損傷模型。利用對乙酰氨基酚建立損傷模型，并用白藜蘆醇進行干預(yù)，白藜蘆醇給藥質(zhì)量濃度梯度為0、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL，培養(yǎng)24 h，根據(jù)MTT法檢測細胞存活率。

2.3 MTT法檢測細胞存活率 對數(shù)生長期細胞給藥處理24 h后，每孔避光加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，使MTT與活細胞中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成藍紫色結(jié)晶甲臜，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，于搖床混勻20 min溶解甲臜，酶標儀波長490 nm，檢測吸光度(OD)值，并計算細胞存活率。

2.4 細胞形態(tài)學觀察 細胞給藥培養(yǎng)的同時，觀察細胞形態(tài)變化。細胞在1 000 μg/mL對乙酰氨基酚的培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡(400倍)下觀察細胞形態(tài)變化并拍照分析。

2.5 熒光探針活性氧檢測 使用白藜蘆醇終質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、5 μg/mL干預(yù)對乙酰氨基酚損傷細胞24 h后，利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測。無熒光的DCFH被細胞內(nèi)的活性氧氧化，生成熒光分子DCF，通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞內(nèi)活性氧的水平。

2.6 細胞凋亡檢測 收集各組細胞，離心，棄上清，用0.01 mol/L PBS重懸，計數(shù)后向流式管中加入2×105個細胞，再依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidiumiodide，溫和混勻，室溫條件下避光孵育15 min，往流式管中加入400 μL 1×Binding buffer，混勻后進行流式細胞檢測。

2.7 Hoechst染色 培養(yǎng)后的各組細胞進行固定、染色、涂片，使用Hoechst 33258進行細胞染色，在熒光倒置顯微鏡下，觀察細胞凋亡情況。

2.8 細胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測 細胞培養(yǎng)后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入裂解液進行裂解后，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，按照試劑盒說明書步驟檢測上清液中CAT、SOD活性和GSH 水平。

2.9 細胞中炎性反應(yīng)相關(guān)指標檢測 收集細胞培養(yǎng)液離心，按照碧云天試劑盒中說明書，采用Griess reagent法檢測上清中總NO 水平。使用裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液上清，按試劑盒說明書步驟檢測細胞中iNOS的活性。

2.10 RT-qPCR檢測CAT、HO-1、iNOS、IL-6、IL-1βmRNA表達 使用RNA試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并進行PCR擴增實驗。RT-qPCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。引物序列如下，CAT[17]正向引物5′-CACTGACGAGATGGCACACT-3′，反向引物5′-TGTGGAGAATCGAACGGCAA-3′；HO-1正向引物5′-AGATGGCGTCACTTCGTC-3′，反向引物5′-GGCAAGATTCTCCCTTACAG-3′；iNOS正向引物5′-CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3′，反向引物5′-GGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA-3′；IL-1β正向引物5′-TCAAATCTCGCAGCAG CACATC-3′，反向引物5′-CCAGCAGGTTA-TCATCATCATCCC-3′；IL-6正向引物5′-ATGGATGCTACCAAACTGGAT-3′，反向引物5′-TGAAGGACTCTGGCTTTGTCT-3′；GAPDH[18]正向引物5′-TGGCAAAGTGGAGATTG TTGC-3′，反向引物5′-AAGATGGTGATGGGCT TCCCG-3′。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞存活率的影響 如圖1A所示，各組RAW264.7細胞的存活率與正常組比較均降低(P<0.01)，且與對乙酰氨基酚劑量呈負相關(guān)。實驗選定500 μg/mL對乙酰氨基酚建立細胞損傷模型，如圖1B所示，與模型組比較，白藜蘆醇給藥后細胞存活率升高(P<0.05，P<0.01)，質(zhì)量濃度為1 μg/mL時，細胞存活率最高。

注：與正常組(0 μg/mL APAP)比較，##P<0.01；與模型組(500 μg/mL APAP)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞存活率的影響Fig.1 Effect of resveratrol on the survival rate of APAP-injured

3.2 對乙酰氨基酚對細胞形態(tài)及細胞凋亡的影響 正常RAW264.7細胞為圓形或橢圓形(圖2A)；1 000 μg/mL對乙酰氨基酚給藥后，觀察到部分細胞分化伸出偽足，出現(xiàn)少量梭狀細胞，細胞形態(tài)如圖2B所示。與正常組比較，1 000 μg/mL對乙酰氨基酚組細胞密度明顯降低，細胞培養(yǎng)基顏色也可反映出細胞生長繁殖情況，正常組細胞密度高，對培養(yǎng)基營養(yǎng)需求旺盛，大量消耗培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)后，分泌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致細胞培養(yǎng)液變黃。

圖2 對乙酰氨基酚對細胞形態(tài)的影響(×400)Fig.2 Effects of APAP on morphology of cells(×400)

如圖3所示，經(jīng)流式細胞凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)細胞在對乙酰氨基酚給藥后出現(xiàn)細胞凋亡和壞死現(xiàn)象，說明對乙酰氨基酚具有一定細胞毒性，會抑制巨噬細胞生長并促進細胞凋亡，故對乙酰氨基酚給藥組(圖2B)細胞密度較對照組明顯降低。

圖3 細胞凋亡流式分析Fig.3 Detection of cell apoptosis by ow cytometry

3.3 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞內(nèi)ROS水平的影響 如圖4所示，與正常組比較，對乙酰氨基酚損傷細胞24 h后，熒光信號增強，表明細胞內(nèi)活性氧水平明顯增加；與模型組比較，白藜蘆醇處理損傷細胞24 h后，出現(xiàn)熒光信號減弱現(xiàn)象，表明白藜蘆醇能減少細胞中ROS產(chǎn)生。

圖4 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中活性氧水平的影響(×200)Fig.4 Effects of resveratrol on active oxygen level of APAP-injured cells(×200)

3.4 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)細胞凋亡的干預(yù) 如圖5所示，正常組細胞核呈均一藍色；對乙酰氨基酚損傷后細胞，染色質(zhì)固縮，細胞核呈致密濃染、或碎塊狀致密濃染，顏色呈白色，提示發(fā)生了大量細胞凋亡；不同劑量白藜蘆醇干預(yù)后，視野中的凋亡細胞明顯減少。

圖5 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷后細胞凋亡的影響(×400)Fig.5 Effect of resveratrol on apoptosis of APAP-induced cells(×400)

3.5 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中氧化應(yīng)激指標的影響 如圖6所示，與正常組比較，模型組CAT、SOD活性和GSH 水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組細胞CAT、SOD活性和GSH 水平均升高(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。

注：A為CAT活性，B為SOD活性，C為GSH的標準曲線，D為GSH水平。與正常組(0 μg/mL APAP)比較，##P<0.01；與模型組(500 μg/mL APAP)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中抗氧化指標的影響Fig.6 Effects of resveratrol on antioxidant enzymes in APAP-injured

3.6 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞上清液中NO水平的影響 如圖7所示，與正常組比較，模型組細胞NO水平增加(P<0.01)；與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組細胞NO水平均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

注：A為NO標準曲線，B為NO水平。與正常組(0 μg/mL APAP)比較，##P<0.01；與模型組(500 μg/mL APAP)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷后細胞NO水平的影響Fig.7 Effect of resveratrol on NO level of APAP-injured

3.7 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中iNOS活性的影響 如圖8所示，與正常組比較，模型組細胞中iNOS活性增加(P<0.01)；比較模型組比較，白藜蘆醇各劑量組細胞中iNOS活性降低(P<0.05，P<0.01)。iNOS被激活后，會持續(xù)產(chǎn)生NO，白藜蘆醇能夠抑制iNOS活性，降低NO水平，與圖7結(jié)果一致。

注：與正常組(0 μg/mL APAP)比較，##P<0.01；與模型組(500 μg/mL APAP)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖8 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中iNOS活性的影響Fig.8 Effect of resveratrol on iNOS activity of APAP-injured

3.8 白藜蘆醇對對乙酰氨基酚損傷細胞中CAT、HO-1、iNOS、IL-1β和IL-6表達的影響 如圖9所示，與正常組比較，模型組細胞中CAT、HO-1 mRNA表達均降低(P<0.01)，iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組細胞中CATmRNA表達均升高(P<0.01)，iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達均降低(P<0.05，P<0.01)。提示對乙酰氨基酚誘發(fā)了細胞炎癥反應(yīng)，白藜蘆醇給藥后，炎癥因子表達降低，表明白藜蘆醇具有抑制炎癥作用。

4 討論

對乙酰氨基酚損傷巨噬細胞假想途徑可能是，對乙酰氨基酚誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，細胞中CAT、SOD活性降低，GSH 水平降低，iNOS被激活，轉(zhuǎn)化L-精氨酸為L-瓜氨酸，持續(xù)產(chǎn)生NO[19-20]。白藜蘆醇干預(yù)損傷細胞后，細胞抗氧化能力提高，抑制iNOS活性，降低細胞NO水平。白藜蘆醇給藥后通過清除ROS緩解氧化應(yīng)激作用和炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明對乙酰氨基酚對巨噬細胞具有細胞毒性。用活性氧熒光探針對細胞染色，觀察到對乙酰氨基酚給藥后，細胞中熒光信號加強，說明對乙酰氨基酚誘發(fā)了細胞中氧自由基的產(chǎn)生。SOD、CAT是胞內(nèi)重要抗氧化酶，參與胞內(nèi)氧自由基的清除反應(yīng)，模型組細胞中抗氧化酶SOD、CAT活性及抗氧化多肽GSH水平降低，表明對乙酰氨基酚會誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生氧應(yīng)激反應(yīng)；白藜蘆醇干預(yù)后，細胞中活性氧探針熒光強度降低，提示細胞中氧自由基減少，細胞內(nèi)的SOD、CAT活性及GSH水平升高，細胞生存率也升高，推測白藜蘆醇可通過緩解細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)進而保護細胞。NO是重要的炎癥因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，也是細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的標志產(chǎn)物，iNOS可以催化精氨酸分解為NO。本研究檢測發(fā)現(xiàn)模型組細胞NO水平及iNOS活性均升高，推測對乙酰氨基酚誘發(fā)細胞炎癥反應(yīng)，激活iNOS表達，從而促進NO的釋放；白藜蘆醇干預(yù)后，iNOS活性及NO水平均降低，表明白藜蘆醇緩解了細胞炎癥反應(yīng)。對乙酰氨基酚損傷后細胞中抗氧化基因CAT、HO-1表達降低，炎癥因子IL-1β、IL-6及iNOS表達升高，表明對乙酰氨基酚造成的巨噬細胞損傷可能是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)；白藜蘆醇干預(yù)后，細胞CAT、HO-1表達升高并且IL-1β、IL-6和iNOS表達降低，推測白藜蘆醇減輕對乙酰氨基酚造成的細胞損傷可能是通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

注：A～E分別為白藜蘆醇處理后細胞中CAT、HO-1、iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達。與正常組(0 μg/mL APAP)比較，##P<0.01；與模型組(500 μg/mL APAP)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖9 各組細胞CAT、HO-1、iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達Fig.9 mRNA expressions of CAT,HO-1,iNOS,IL-1β and IL-6 of cells in each

綜上所述，對乙酰氨基酚對巨噬細胞具有細胞毒性，能同時誘發(fā)細胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，與之前學者在對乙酰氨基酚對肝細胞損傷中觀察到現(xiàn)象一致。本研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能上調(diào)對乙酰氨基酚損傷細胞中抗氧化酶的表達，減少細胞中氧自由基水平，這可能是白藜蘆醇保護細胞損傷的重要原因。

對乙酰氨基酚是常見退燒藥物，目前對其毒副作用研究主要聚焦在其對肝臟的損傷及機制方面[21]，本研究結(jié)果顯示對乙酰氨基酚具有促進巨噬細胞凋亡，并誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，提示對乙酰氨基酚可能對機體巨噬細胞也存在損傷的風險，具體機制有待后續(xù)深入研究。