毛葉勤，陳 琳*，吳 育，陳 剛

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215006；2.南通市中醫(yī)院藥劑科，江蘇 南通 226000)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種以黏膜和黏膜下持續(xù)炎癥為特征的慢性疾病，因機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂，難治愈，易復(fù)發(fā)[1]，目前該病已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因，患者多為青壯年[2]。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，腸損傷引起的免疫應(yīng)答和炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)可導(dǎo)致T細(xì)胞在炎癥的腸道內(nèi)積聚，導(dǎo)致腸黏膜上皮屏障的損傷和功能障礙，最終觸發(fā)或加重其發(fā)生發(fā)展[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明，具有多成分、多靶點(diǎn)的中藥輔助治療有利于緩解潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，療效可靠，副作用少，復(fù)發(fā)率低。蒲公英含酚酸、黃酮、多糖等類活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗胃損傷、利膽保肝等作用[4]。臨床常用于呼吸道疾病、胃腸道炎癥、肝損傷、2型糖尿病等疾病的治療[5]。有研究證明蒲公英水提物可通過抗炎作用改善實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠癥狀，但對(duì)與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)、黏膜愈合作用以及灌腸局部給藥的研究卻未見報(bào)導(dǎo)[6]。因此，本研究旨在通過三硝基苯磺酸聯(lián)合乙醇誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，進(jìn)一步研究蒲公英水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)黏膜愈合的作用，以期為蒲公英藥物在潰瘍性結(jié)腸炎臨床的治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 36只SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2017-0005，常規(guī)飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h/12 h交替照明。所有實(shí)驗(yàn)研究符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則，倫理批準(zhǔn)號(hào)170373。

1.2 藥材來(lái)源及鑒定 蒲公英購(gòu)于河北省安國(guó)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)專業(yè)巢建國(guó)教授鑒定為菊科植物蒙古蒲公英TaraxacummongolicumHand-Mazz.的干燥全草。

1.3 試劑與藥物 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(批號(hào)021771，美國(guó)Sigma公司)；隱血試劑盒(批號(hào)20160824)、大鼠白介素-2(IL-2)(批號(hào)20170910)、白介素-8(IL-8)(批號(hào)20170910)、白介素-10(IL-10)(批號(hào)20170910)、白介素-17(IL-17)(批號(hào)20170910)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號(hào)20170912)、C反應(yīng)蛋白(CRP)(批號(hào)20170911)、髓過氧化物酶(MPO)(批號(hào)20170915)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(批號(hào)20170917)、大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)(批號(hào)20170917)均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。水合氯醛(批號(hào)20150203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(批號(hào)A14081805，貴州順創(chuàng)和藥業(yè)有限公司)；無(wú)水乙醇(批號(hào)20131008，天津市福晨化學(xué)試劑廠)。

1.4 儀器 SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；先行者CP214型電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TLC16M型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)。

1.5 蒲公英水提物的制備 稱取蒲公英干燥全草100 g置于多功能提取罐，加入10倍量的水，煮沸提取3次，每次1 h，合并提取液，用400目濾布過濾，所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠浸膏狀后冷凍干燥，即得蒲公英水提物，得率為16.80%。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎模型建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水24 h，隨機(jī)選取6只大鼠作為正常組，剩余大鼠參照張漢超等[7]描述方法，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，然后將1根聚乙烯導(dǎo)管(長(zhǎng)度為10 cm，外徑為2 mm)通過肛門小心地插入結(jié)腸管腔，其尖端位于肛門近端約8 cm處，使大鼠頭部向下，將0.3 mL 5% TNBS溶于0.3 mL 30%乙醇中，通過安裝在1 mL注射器上的導(dǎo)管緩慢注入管腔，緩緩拔出導(dǎo)管，使大鼠保持頭部朝下姿勢(shì)10 s，以確保TNBS-乙醇溶液在結(jié)腸內(nèi)分布，隨后將大鼠放入籠中，仰臥位，待其自然蘇醒。正常對(duì)照組，平行操作，但僅用等體積的0.9%生理鹽水代替。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 TNBS造模后第1天，大鼠參考Hamamoto等[8]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分，按照炎癥程度，極輕度炎癥(0～3分)、輕度炎癥(4～6分)、中度炎癥(7～9分)、重度炎癥(10～12分)對(duì)模型大鼠進(jìn)行分組。剔除模型中評(píng)分最低(2只)和最高(4只)的大鼠，剩余大鼠按炎癥程度采用分層隨機(jī)抽樣的方式分為模型組、奧沙拉嗪(200 mg/kg)組和蒲公英水提物高(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)劑量組，每組6只，造模后第8天開始灌腸給藥，正常組和模型組給予生理鹽水灌腸，蒲公英水提物各劑量組和奧沙拉嗪組給予相應(yīng)藥物灌腸，每天1次，連續(xù)給藥14 d，于造模后第1、4、7、10、14、21天對(duì)各組大鼠造模后體質(zhì)量、糞便性狀及隱血情況進(jìn)行記錄，評(píng)價(jià)DAI評(píng)分的改善情況。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 末次給藥后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3.0 mL/kg)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上層血清，用試劑盒檢測(cè)IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、CRP水平。解剖取胸腺、肝臟、脾臟、肺臟等臟器，稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。沿腸系膜緣剪開腸腔，預(yù)冷生理鹽水洗經(jīng)腸內(nèi)容物記錄結(jié)腸長(zhǎng)度、寬度，稱定質(zhì)量。參照表1標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonmucosa damage index,CMDI)評(píng)分。將結(jié)腸組織縱向剪取一半稱定質(zhì)量，按1∶9加入預(yù)冷生理鹽水勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒檢測(cè)組織上清液中IL-2、EGF、MPO、TGF-β水平。剩余結(jié)腸用 40 g/L甲醛固定，制作病理切片，參照表1標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行病理組織學(xué)(histopathological score，HS)評(píng)分。

表1 結(jié)腸黏膜肉眼及鏡下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Macroscopic and microscopic scoring standards for colonic mucosa

3 結(jié)果

3.1 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI的影響 如表2所示，造模后第7天，與正常組比較，經(jīng)TNBS灌腸處理的各組大鼠DAI評(píng)分升高(P<0.01)，提示造模成功，且各TNBS處理組間DAI評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示給藥前各TNBS處理組大鼠炎癥程度基本一致。隨著奧沙拉嗪和蒲公英水提物給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，DAI評(píng)分呈逐漸降低趨勢(shì)。給藥14 d后(造模后第21天)，與正常組比較，模型組大鼠DAI評(píng)分升高(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物高劑量組大鼠DAI評(píng)分降低(P<0.05)，蒲公英提取低劑量組大鼠DAI評(píng)分有下降趨勢(shì)(P>0.05)。

3.2 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠臟器指數(shù)的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)升高(P<0.01)，胸腺指數(shù)降低(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠肝臟指數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05)，胸腺指數(shù)升高(P<0.05，P<0.01)，脾臟指數(shù)降低(P<0.01)。

3.3 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的影響 如表4所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短(P<0.01)，結(jié)腸長(zhǎng)寬比降低(P<0.01)，CMDI和結(jié)腸指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸長(zhǎng)寬比增加(P<0.05，P<0.01)，CMDI和結(jié)腸指數(shù)降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠DAI評(píng)分Tab.2 DAI scores of rats in each

表3 各組大鼠臟器指數(shù)Tab.3 Organ indices of rats in each

表4 各組大鼠結(jié)腸相關(guān)指標(biāo)Tab.4 Colon-related indicators of rats in each

3.4 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清炎癥因子的影響 如表5所示，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-8、IL-17、CRP、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)。與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠血清IL-8、IL-17、CRP、TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)。

表5 各組大鼠血清IL-8、IL-10、IL-17、CRP、TNF-α水平Tab.5 Serum levels of IL-8,IL-10,IL-17,CRP and TNF-α of rats in each

3.5 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸細(xì)胞因子的影響 如表6所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-2、MPO水平升高(P<0.01)，EGF、TGF-β水平降低(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組及蒲公英水提物各劑量組大鼠結(jié)腸IL-2、MPO水平降低(P<0.01)，EGF水平升高(P<0.01)，但TGF-β水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3.6 蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸病理變化的影響 如表7、圖1所示，模型組病理圖片中大部分杯狀細(xì)胞和隱窩結(jié)構(gòu)消失，有黏膜組織壞死、出血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)到黏膜肌層。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及HS總評(píng)分均增加(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞評(píng)分、炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分、HS總評(píng)分均降低(P<0.01)，蒲公英水提物高劑量組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分和HS總評(píng)分降低(P<0.05)，蒲公英水提物高劑量組上皮細(xì)胞評(píng)分和低劑量組各病理評(píng)分均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表6 各組大鼠結(jié)腸 IL-2、MPO、EGF、TGF-β水平Tab.6 Colon tissue levels of IL-2,MPO,EGF and TGF-β of rats in each

表7 各組大鼠結(jié)腸病理評(píng)分Tab.7 HS scores of rats in each

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)評(píng)分(HE,×200)Fig.1 Histopathological scores of colon tissue of rats in each group (HE，×200)

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是由結(jié)腸組織持續(xù)性炎癥介導(dǎo)的，其特征是免疫細(xì)胞的強(qiáng)烈激活、促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)和黏附分子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腸黏膜上皮屏障的損害和功能障礙[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)蒲公英水提物治療后顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠一般臨床癥狀，結(jié)腸長(zhǎng)度增加，腸黏膜表面較模型組光滑，潰瘍紅腫減少或消失，CMDI評(píng)分降低；鏡下檢查可見黏膜結(jié)構(gòu)完整性得到改善，隱窩和上皮細(xì)胞丟失減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，HS總評(píng)分降低。MPO已被用作結(jié)腸黏膜中炎癥和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的定量指標(biāo)，其水平的降低可以解釋為抗炎性能的表現(xiàn)。蒲公英水提物能抑制結(jié)腸炎大鼠MPO的水平，提示炎性病變有所減輕。CRP是急性炎癥反應(yīng)的代表性生物標(biāo)志物，對(duì)人體的炎癥反應(yīng)具有很高的敏感性，與患者內(nèi)鏡活動(dòng)呈正相關(guān)，經(jīng)常被用來(lái)驗(yàn)證潰瘍性結(jié)腸炎的緩解程度和黏膜愈合[12]。蒲公英水提物治療能降低CRP水平，提示黏膜愈合度得到改善。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)蒲公英水提物的促黏膜愈合作用機(jī)制，對(duì)結(jié)腸組織的促修復(fù)因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，EGF水平升高，提示蒲公英水提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠損傷黏膜具有保護(hù)作用。

IL-2由輔助性T淋巴細(xì)胞受刺激誘導(dǎo)分泌，其水平高低間接反映了宿主T淋巴細(xì)胞活化程度及宿主免疫系統(tǒng)清除衰老變性細(xì)胞、自體變性和損傷細(xì)胞方面的能力大小[13]。IL-8是一種強(qiáng)而有力的中性粒細(xì)胞活化和趨化因子，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的溶酶體酶活性和吞噬作用，其檢測(cè)可作為臨床上判斷疾病嚴(yán)重程度和療效的指標(biāo)[14]。TNF-α是與潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，能引起細(xì)胞壞死、間質(zhì)中蛋白質(zhì)破壞和水腫的發(fā)生，促進(jìn)胃腸細(xì)胞的組織損害及上皮細(xì)胞的凋亡[15-16]，加重黏膜損傷[17]。IL-10是重要的多效性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其主要抑制IL-2、IL-8、TNF-α等的分泌和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化與增殖，減少可溶性TNF-α受體等抗炎蛋白的表達(dá)，從而限制和終止炎癥反應(yīng)[18]。IL-17是由CD4+T細(xì)胞輔助亞群分泌的一種強(qiáng)促炎因子，研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)IL-17水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19-20]。在本研究中，經(jīng)蒲公英水提物治療后，IL-8、IL-17、TNF-α和IL-2水平降低，IL-10水平升高。提示蒲公英水提物可以通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)平衡，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

綜上所述，蒲公英水提物對(duì)TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠具有治療作用，以高劑量作用最佳，其機(jī)制可能與減輕結(jié)腸組織免疫炎性損傷，并通過提高促修復(fù)因子水平，促進(jìn)損傷黏膜愈合，最終達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的。