黃睿玨，溫小娟，李若陽，李 博，何 博，王 磊，陳柏君，熊 磊，郜發(fā)寶*

(1.云南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.四川大學華西醫(yī)院放射科，四川 成都 610041；3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610041；4.四川大學華西醫(yī)院分子影像研究室，四川 成都 610041)

心臟磁共振作為一項安全、無創(chuàng)的影像檢測技術，以其多參數(shù)、多序列、高分辨率等優(yōu)勢可綜合評估心臟結構、功能、組織特征和灌注，目前廣泛應用于心血管的臨床診斷與科學研究，已成為心臟評估的金標準[1-4]。組織追蹤技術在心臟磁共振電影序列采集成像的基礎上，通過后處理軟件測量不同方向上整體、局部、節(jié)段的心肌應變參數(shù)，能評估心臟整體和局部運動，具有良好的可行性與重復性[5-6]。

蒼艾揮發(fā)油是基于中醫(yī)傳統(tǒng)熏香療法，采用蒼術、艾葉、藿香、花椒、香薷、佩蘭、石菖蒲等多種氣味清香、辛散走串、芳香開竅的藥材經(jīng)現(xiàn)代萃取工藝提煉制成的揮發(fā)油復方制劑。研究表明，蒼艾揮發(fā)油經(jīng)吸入給藥可調(diào)節(jié)大鼠大腦多巴胺和5-羥色胺的代謝，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、突觸囊泡膜蛋白表達與傳遞效能進而改善大鼠抑郁樣行為[7-8]；加快對大鼠腦缺血再灌注后的腦神經(jīng)纖維束恢復，可能具有腦神經(jīng)保護功能[9]；保護小鼠上呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)，進而降低被動吸煙對上呼吸道的損傷[10]，但目前尚無該成分在心血管疾病領域中的研究報道。

前期發(fā)現(xiàn)，蒼艾揮發(fā)油富含揮發(fā)性成分丁香酚[7]，對大鼠心臟移植過程中所出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷具有心肌保護作用[11]，并且原料中的石菖蒲[12-13]對心肌梗死、急性心肌缺血損傷具有保護作用，但它作為一種由多種藥材提煉合成的揮發(fā)油制劑，對心血管是否也具有安全性或保護作用尚不明確。因此，本實驗首次采用7.0T心臟磁共振成像探索蒼艾揮發(fā)油通過腹腔注射、灌胃、霧化吸入對正常大鼠的心肌保護作用，并評價其差異，以期為后續(xù)開展該成分在心血管疾病領域中的藥效與最佳用藥方式研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 40只健康雄性SPF級SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。研究經(jīng)四川大學華西醫(yī)院實驗動物保護和使用委員會批準，批準號SYXK(川)2013-119。

1.2 藥物 蒼艾揮發(fā)油原油均由云南中醫(yī)藥大學提供，采用水蒸餾法提取，相關藥材均購自云南白藥集團中藥資源有限公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室楊竹雅副教授鑒定為正品[8-9]。制備方法為取等量蒼術、艾葉，與藿香、花椒、香薷、佩蘭、石菖蒲按2∶1比例混合粉碎后置于圓底燒瓶中，加入8倍蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸2 h，提取具有芳香氣味的揮發(fā)油液體(得率為3.6%)，無水硫酸鈉除去揮發(fā)油中殘留水分，封閉放入4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆肹7]，實驗時加入5%吐溫-80(美國Sigma公司)助溶液、0.9% NaCl溶液，制成4%稀釋液。

1.3 儀器 7.0T磁共振掃描儀(德國Bruker公司)；SNAII Model 1030小動物監(jiān)護/門控系統(tǒng)(美國Small Animal Instruments公司)；MATRX VIP3000小動物呼吸麻醉機(美國Midmakrk公司)；SA-YLS-8B小動物霧化給藥系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將40只大鼠隨機分成4組，每組10只，分別為腹腔注射組、灌胃組、霧化吸入組和對照組。腹腔注射組按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射給藥，每天1次；灌胃組按0.3 mL/100 g劑量灌胃給藥，每天1次；霧化吸入組按霧化給藥，每天20 min，各組持續(xù)給藥14 d。給藥結束后，各組均進行心臟磁共振成像掃描。

2.2 心臟磁共振成像掃描 使用7.0T磁共振對各組大鼠進行心臟掃描，選用內(nèi)徑72 mm的鳥籠射頻信號發(fā)射線圈、56 mm的列陣表面回波信號接收線圈。將大鼠置于密閉的玻璃缸內(nèi)，并通入氧氣與2%異氟烷的混合氣體誘導麻醉，迅速轉(zhuǎn)移至磁共振掃描床，使用大鼠專用面罩持續(xù)進行吸入麻醉，在大鼠雙前肢與右后肢插入心電電極，在腹部放置呼吸感應裝置，待心電、呼吸平穩(wěn)后進床行磁共振掃面，心臟掃描采用梯度回波電影序列(Cine-Flash-flc)，設置參數(shù)為重復時間(TR)8.0 ms，回波時間(TE)2.5 ms，反轉(zhuǎn)角(FA)15°，層厚1.5 mm，層間0 mm，每個心動周期電影時相18，視野范圍(FOV)50 mm×50 mm，矩陣大小(matrix size)192×192，重復次數(shù)(NEX)4，掃描時間(TA)2 min，先進行大鼠胸部定位序列掃描，獲得心臟橫斷位、冠狀位、矢狀位三個方向上的定位圖像，在確定心臟位于發(fā)射線圈正中后，參考定位像掃描一層清晰的左室短軸位，再依次掃描出四腔心長軸位與兩腔心長軸位，最后在兩腔心或四腔心長軸位基礎上由心底至心尖掃描連續(xù)的左室短軸位。

2.3 圖像后處理 將所有掃描后的圖像以DICOM格式導入專業(yè)心臟后處理軟件CVI42(加拿大Circle Cardiovascular Imaging公司)進行分析。心功能分析方法為在軟件中Short-3D模塊通過添加連續(xù)的左室短軸圖像，并于舒張末期與收縮末期分別手動勾畫出左心室內(nèi)外膜，獲得左心室舒張末期容積(end-diastolic volume,EDV)、左心室收縮末期容積(end-systolic volume,ESV)、每搏輸出量(stroke-volume,SV)、射血分數(shù)(ejection fraction,EF)等心功能指標，其中乳頭肌和左室流出道計算在血池容積與心室容積內(nèi)；心肌應變分析方法為在Tissue-Tracking模塊添加連續(xù)的左室短軸圖像以及四腔、二腔2個長軸圖像后進行心肌分析，在各層舒張末期時相上勾畫左心室內(nèi)外膜，同時手動標記室間隔，并由軟件通過自動追蹤心肌像素點的運動和位置變化最終獲取左心室短軸方向上的整體徑向應變(global peak radial strain,GRS)、整體環(huán)向應變(global peak circumferential strain,GCS)、整體縱向應變(global peak longitudinal strain,GLS)等二維(two-dimensional,2D)、三維(three-dimensional,3D)心肌應變參數(shù)。有學者證實，2D應變參數(shù)的重復性高于3D應變參數(shù)[14-15]，故本實驗僅納入2D心肌應變參數(shù)進行探討。

2.4 病理學檢查 心臟磁共振掃描完成當天，尾靜脈注射氯化鉀處死大鼠，取出完整心臟，去除心耳，0.9% NaCl溶液沖洗凈心腔內(nèi)剩余血液，將完整心肌組織用甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡下觀察心肌組織。

3 結果

3.1 組織病理學 各給藥組大鼠心肌組織與對照組正常大鼠相似，心肌細胞排列規(guī)則，細胞形態(tài)結構、細胞質(zhì)、細胞間質(zhì)及縱、橫紋等均正常，未見壞死、變性、肥大、炎性浸潤等任何損傷現(xiàn)象，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色(×40)Fig.1 HE staining for myocardial tissues of rats in each group (×40)

3.2 蒼艾揮發(fā)油對大鼠EDV、ESV的影響 不同給藥方式之間EDV差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中霧化吸入組高于對照組、灌胃組(P<0.05)，而ESV均無明顯變化(P>0.05)，見圖2～3。

注：與對照組比較，**P<0.01；與灌胃組比較，#P<0.05。圖2 蒼艾揮發(fā)油對大鼠EDV、ESV的影響Fig.2 Effects of Cang-Ai volatile oils on EDV and ESV in rats

3.3 蒼艾揮發(fā)油對大鼠SV、EF的影響 與對照組比較，腹腔注射組、霧化吸入組SV升高(P<0.05，P<0.01)，給藥組EF均升高(P<0.01)，并且霧化吸入組SV高于灌胃組(P<0.05)，見圖4。

3.4 蒼艾揮發(fā)油對大鼠GRS、GCS、GLS的影響 與對照組比較，腹腔注射組、霧化組GRS、GCS高于對照組(P<0.05)，并且腹腔注射組兩者高于灌胃組(P<0.01，P<0.05)，見圖5。

注：A～C分別為左室短軸位舒張末期時相、左室長軸位四腔心舒張末期時相、左室長軸位二腔心舒張末期時相。圖3 各組大鼠心臟磁共振電影序列圖像Fig.3 Images of cardiac magnetic resonance cine sequence of rats in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與灌胃組比較，#P<0.05。圖4 蒼艾揮發(fā)油對大鼠SV、EF的影響Fig.4 Effects of Cang-Ai volatile oils on SV and EF in rats

注：A為16段應變的牛眼圖[不同顏色表示應變在-20(藍/綠過渡)到20(綠/紅過渡)之間]，B為蒼艾揮發(fā)油對大鼠GRS、GCS和GLS的影響。GRS表示心肌向心腔中心的徑向增厚與變薄運動，用正值表示；GCS表示心肌沿著圓周方向上的縮短，用負值表示；GLS表示心肌從心底部到心尖的縱向縮短，用負值表示。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與灌胃組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 蒼艾揮發(fā)油對大鼠GRS、GCS、GLS的影響Fig.5 Effects of Cang-Ai volatile oils on GRS,GCS and GLS in

4 討論

心血管疾病是目前全球致死人數(shù)最多的非傳染性疾病之一，心功能受損是其主要表現(xiàn)，也是加速患者死亡的主要原因。本實驗首次基于7.0T心臟磁共振評價蒼艾揮發(fā)油經(jīng)腹腔注射、灌胃、霧化吸入3種給藥途徑對正常大鼠的心臟功能的影響，發(fā)現(xiàn)該成分能不同程度增強心臟收縮功能。

目前，缺少蒼艾揮發(fā)油對心血管作用最佳的給藥方案，因此本實驗對比了3種給藥方式對心臟功能的影響，發(fā)現(xiàn)腹腔注射、霧化吸入效果更顯著，特別是前者，可能是由于在相同的劑量濃度下腸系膜、腹膜的直接吸收較灌胃吸收更快，效率更高，但在病理取材時發(fā)現(xiàn)有不同程度的腸系膜、腹膜黏連，推測是長期腹腔注射、藥物刺激導致的，需加以關注。另外，霧化吸入與腹腔注射給藥對心臟正性肌力作用效果相似，前期報道蒼艾揮發(fā)油經(jīng)鼻吸入后心臟是藥物的主要靶器官之一，而且肝首過效應低，藥物吸收、分布快[16]，該方式單次給藥時間與濃度的確立主要依據(jù)前期實驗基礎[9]。因此，對心血管疾病的后續(xù)研究，霧化吸入是蒼艾揮發(fā)油的首選給藥方式。

心室容積、壓力、SV、EF是評價心功能的重要指標[17-19]，在生理狀態(tài)下對于心室整體而言，隨著EDV增加，心室做功越多，SV就越多，而且EDV可反映心肌纖維收縮的初長度，與心肌收縮力成正相關[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，蒼艾揮發(fā)油3種給藥方式均可提升大鼠左心室SV、EF、EDV，但對ESV無明顯影響。Nakahashi等[21]發(fā)現(xiàn)，尼可地爾可增加左心室前負荷，提高正常成年大鼠左心SV、EF、EDV，與本實驗結果一致，提示在蒼艾揮發(fā)油的作用下靜脈回心血量增加，心室做功加強，心肌纖維收縮力升高。

左心室的運動是一個復雜的過程，相比EF，通過心肌應變評估其功能具有更高的靈敏度[22]。心肌應變是心動周期過程中心肌纖維在前后負荷作用下收縮、舒張產(chǎn)生的形變，由心肌纖維的舒張末期的初始長度與收縮末期的最大長度決定[23]，本實驗發(fā)現(xiàn)各給藥組大鼠心肌GRS、GCS均較正常大鼠增高，但GLS無明顯變化。文獻[24-26]報道，正性肌力藥物多巴酚丁胺對正常大鼠在藥物輸入應激態(tài)時，可顯著提升心肌GCS、GRS、心率、EF與心肌扭轉(zhuǎn)、壓力、容積等指標，與本實驗結果類似。心肌的環(huán)向應變可反映心肌中層環(huán)狀排列的心肌纖維與心外膜左手螺旋走形的斜行纖維的運動形變，徑向應變可反映內(nèi)、中、外三層心肌纖維的共同運動情況。因此，本實驗GCS、GRS的升高提示三層心肌纖維做功增強，這也符合用藥后的心室容積變化，心肌纖維在前負荷的作用下收縮運動增強，最終表現(xiàn)出SV、EF升高。

綜上所述，蒼艾揮發(fā)油能增強正常大鼠心臟收縮功能，以霧化吸入給藥方式效果更理想，可為研究該成分的心臟保護作用提供依據(jù)，也能為后續(xù)開展其干預心血管疾病的考察奠定基礎。