彭小園，陳子月，崔 兵，王 月，張 闖，李愛英，劉興超*，張一昕*

[1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；4.景忠山國藥(唐山)有限公司，河北 唐山 063000]

耳聾膠囊由黃芩、龍膽、木通、梔子、甘草等10種中藥組成[1]，具有清肝、瀉火、利濕、通竅功效[2-3]，但其執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)僅對黃芩苷進(jìn)行定量分析，難以作為整體質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。因此，應(yīng)選擇多種與功效相關(guān)的有效成分或主要成分作為檢測指標(biāo)，來對耳聾膠囊進(jìn)行全面質(zhì)量控制[4]。

一測多評法由王智民等[5]首次提出，是利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過測定內(nèi)標(biāo)含量來建立與其他成分之間的相對校正因子，從而實現(xiàn)對多種成分含量的同步測定[6]，由于其高效、簡捷、成本低的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價[7-8]，并且該方法與中醫(yī)理論的整體觀念相符，符合中藥多成分、多指標(biāo)的發(fā)展需求，解決了對照品價格昂貴或不易制備的問題，結(jié)合中藥指紋圖譜等技術(shù)能彌補(bǔ)其模糊性的缺點[9]。因此，本實驗首次建立耳聾膠囊HPLC指紋圖譜，并采用一測多評法測定綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，以期為全面控制和評價該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；ME204E102型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號AF9082001，純度98.83%)、黃芩素(批號AF0022325，純度98.86%)、阿魏酸(批號AF20062351，純度99.65%)、龍膽苦苷(批號AF9061002，純度99.75%)、黃芩苷(批號AF20022601，純度98.33%)、漢黃芩素(批號AF0022331，純度98.91%)對照品均購自成都埃法生物科技有限公司。耳聾膠囊共10批(編號S1～S10，批號分別為190202、190802、20030、201001、200901、190502、200903、200302、200902、201002)，購于景忠山國藥(唐山)有限公司。乙腈、磷酸為色譜純；甲醇、乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，95%～92%B；10～15 min，92%～85%B；15～35 min，85%B；35～65 min，85%～70%B；65～85 min，70%～50%B；85～95 min，50%～30%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為0.021 2、0.082 7、0.379 7、0.059 2、0.023 6 mg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例和生產(chǎn)工藝，制備缺黃芩(含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)，缺梔子、當(dāng)歸、九節(jié)菖蒲(含綠原酸)，缺龍膽(含龍膽苦苷)的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液(批號190202)適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.27%、1.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號190202)適量，于0、4、8、12、16、24 h在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.31%、1.58%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取本品(批號 190802)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.40%、2.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 圖譜生成及相似度評價 取10批樣品(S1～S10)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，設(shè)定樣品S1的圖譜作為參照，時間窗寬度0.1 min，采用多點校正全譜峰匹配，共標(biāo)定13個共有峰，平均值法生成指紋圖譜共有模式(R)，見圖1。各批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度分別為1.000、0.993、0.991、0.993、0.995、0.997、0.990、0.990、0.992、0.992、0.995，均大于0.99，以5號峰(黃芩苷)為參照，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.02%～0.11%、1.82%～38.06%，表明不同批次樣品所含成分種類差別不大，但其含量有一定差異。

1.黃芩苷1.baicalin圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜(A)及對照品HPLC色譜圖(B)Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples (A) and HPLC chromatogram of reference substance (B)

2.3.5 聚類分析 采用 SPSS 23.0軟件，以共有峰相對峰面積為變量，通過組間連接和平方歐式距離法繪圖，見圖2。由此可知，10批樣品聚為3類，第1類為S1，第2類為S4、S5、S7，第3類為S2、S3、S6、S8、S9、S10。

圖2 10批樣品樹狀圖Fig.2 Dendrogram of ten batches of samples

2.3.6 主成分分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的2個主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)83.468%，可代表指紋圖譜中各成分的大部分信息，見表1。載荷矩陣可反映各變量對主成分的綜合貢獻(xiàn)[10]，結(jié)合表1特征值和方差貢獻(xiàn)率、因子載荷矩陣進(jìn)行考察，結(jié)果見表2，可知色譜峰9、10、11(黃芩素)、12(漢黃芩素)、13號對主成分1的貢獻(xiàn)率較大，而5(黃芩苷)、6、7、8號對主成分2的貢獻(xiàn)率較大。再采用SIMCA軟件繪制主成分分析得分圖，結(jié)果見圖3，可知10批樣品主要分成3類，與聚類分析結(jié)果一致。

表1 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab.1 Characteristic values and variance contribution rates of principal components

表2 主成分因子載荷矩陣Tab.2 Loading matrices for principal components

圖3 主成分分析得分圖Fig.3 Score plot for principal component analysis

2.4 一測多評法測定各成分含量

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4。由此可知，各成分色譜峰分離度均符合要求，理論塔板數(shù)均大于5 000，陰性無干擾。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1、3、5、7、9 μL，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，每次10 μL，測得綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.23%、0.16%、0.27%、0.11%、0.10%，表明儀器精密度良好。

3.綠原酸 4.龍膽苦苷 5.黃芩苷 11.黃芩素 12.漢黃芩素3.chlorogenic acid 4.gentiopicroside 5.baicalin 11.baicalein 12.wogonin圖4 各成分HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號190202)適量，于0、4、8、12、16、24 h在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為1.58%、1.71%、1.38%、1.68%、0.13%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取本品(批號190802)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為1.80%、1.32%、0.26%、0.12%、0.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品(批號190802)0.04 g，共6份，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液(含綠原酸0.010 6 mg/mL、龍膽苦苷0.041 4 mg/mL、黃芩苷0.189 9 mg/mL、黃芩素0.029 6 mg/mL、漢黃芩素0.011 8 mg/mL)0.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素平均加樣回收率分別為99.39%、101.50%、100.32%、100.00%、100.00%，RSD分別為1.50%、0.70%、0.59%、1.13%、1.63%。

2.4.7 相對校正因子計算 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液2、6、10、14、18 μL，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，計算其他4種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表4。

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.4.8 耐用性試驗 本實驗考察了Thermo Acclaim 120、Agilent Eclipse Plus C18、WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以及Waters e2695、Agilent 1260、Shimadzu LC-20A色譜儀對各成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表5 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.9 樣品含量測定 取10批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評法計算含量，結(jié)果見表6。由此可知，2種方法所得結(jié)果無明顯差異，表明一測多評法合理可行。

表6 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分、內(nèi)標(biāo)選擇 根據(jù)耳聾膠囊10味組方藥材的主要成分及其藥理作用，結(jié)合一測多評指標(biāo)選擇原則和中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則[11]，本實驗選擇君藥龍膽中龍膽苦苷，臣藥黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素及梔子中綠原酸作為指標(biāo)成分[12-13]。另外，以峰面積最大、峰形較好的黃芩苷作為內(nèi)標(biāo)。

3.2 色譜條件選擇 課題組前期檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、龍膽苦苷、黃芩素、漢黃芩素在280 nm波長處吸收最大，而綠原酸在327 nm處有最大吸收[14-15]。本實驗比較了254、280、327 nm波長處的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在280 nm處龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素有最大吸收，綠原酸在327 nm處吸收最大，而龍膽苦苷無吸收。因此，選擇280 nm作為為檢測波長。

3.3 結(jié)果分析 耳聾膠囊HPLC指紋圖譜中有13個共有峰，相似度均在0.990以上，表明該制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，但不同批次樣品中各成分含量有一定差異。化學(xué)計量學(xué)研究結(jié)果顯示，耳聾膠囊分為3類，主成分分析提取得到的2個主成分能代表83.468%的共有峰信息，表明不同批次樣品存在一定的差異性。表6顯示，外標(biāo)法、一測多評法所得結(jié)果基本一致，表明后者可用于耳聾膠囊中各成分含量測定。

4 結(jié)論

中藥復(fù)方制劑涉及中藥繁多，有效成分復(fù)雜，僅對其中一種或者幾種進(jìn)行含量測定難以準(zhǔn)確評價其質(zhì)量[16]。一測多評法與指紋圖譜結(jié)合可從定性、定量兩方面來評價中藥質(zhì)量[17-18]，故本實驗首次建立耳聾膠囊HPLC指紋圖譜，并結(jié)合一測多評法測定綠原酸、龍膽苦苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量，可為全面評價該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。