袁永梅

（黔南州人民醫(yī)院 貴州 黔南 558000）

乳腺癌為臨床婦科常見惡性腫瘤，發(fā)生率位居?jì)D科惡性腫瘤首位，對(duì)患者身心健康、生命安全均存在較為嚴(yán)重的威脅。目前，臨床尚未明確乳腺癌的發(fā)病原因，且疾病發(fā)生率在近年來呈現(xiàn)年輕化、不斷攀升的趨勢(shì)。腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移指的是循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血液循環(huán)中，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入器官、組織后形成轉(zhuǎn)移病灶。影像學(xué)檢查為診斷乳腺癌的重要方式，但是僅能夠檢出直徑＞1 cm 的腫瘤；若腫瘤＜0.1 cm，則需要選擇特異性高、靈敏度高的診斷方式。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）檢測(cè)為近年來新興的腫瘤診斷技術(shù)，相較于傳統(tǒng)組織學(xué)樣本檢測(cè)，該檢測(cè)方法具有可反復(fù)取樣、取材方便、檢測(cè)簡(jiǎn)單、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，有利于臨床早期診斷疾病并判斷預(yù)后，還可預(yù)測(cè)潛在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在分析外周血液腫瘤細(xì)胞檢測(cè)乳腺癌的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年8 月—2021 年8 月黔南州人民醫(yī)院復(fù)查的51 例乳腺癌患者、51 例乳腺良性疾病患者、51 例健康體檢者。51 例乳腺癌患者中，年齡27 ～64 歲，平均年齡（45.57±3.28）歲；51 例乳腺疾病患者中，年齡29 ～62 歲，平均年齡（45.54±3.54）歲；51 例健康體檢者中，年齡28 ～63 歲，平均年齡（45.53±3.42）歲。三組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）CTCs 檢測(cè)：以專用CeHsave 管采集全部研究對(duì)象肘正中靜脈血，采集量為7.5 mL，應(yīng)用美國(guó)強(qiáng)生Veridex 公司的CellTracks Auto Prep 系統(tǒng)對(duì)于標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)后儀器可自動(dòng)完成固定、染色、清洗等操作。將處理后的樣品自動(dòng)轉(zhuǎn)入Mag Nest裝置中進(jìn)行孵育，孵育過程中需要避光。孵育完成后將樣品移入Cell Tracks Auto Prep 系統(tǒng)中實(shí)施熒光掃描，系統(tǒng)可根據(jù)CTCs 免疫熒光染色規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。（2）CTCs 陽性標(biāo)準(zhǔn)：①形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。光鏡下細(xì)胞核較為完整，呈現(xiàn)為橢圓形、圓形、長(zhǎng)形，細(xì)胞最長(zhǎng)直徑＞10 um；②熒光顯微鏡判讀標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞核對(duì)應(yīng)CEF8 信號(hào)點(diǎn)在2 個(gè)以上，不存在血源性白細(xì)胞表面抗原紅圈著色有1 個(gè)陽性細(xì)胞。CTCs ≥1 即可被判定為陽性。（3）血漿游離DNA（Cell-free DNA, cfDNA）定量檢測(cè)：以專用CeHsave 管采集全部研究對(duì)象肘正中靜脈血，采集量為7.5 mL，基于實(shí)驗(yàn)室前期建立ALu 序列RTFO 實(shí)時(shí)熒光定量（realtime fluorescence quantitative, PCR）檢測(cè)的cfDNA 檢測(cè)方法實(shí)施測(cè)定，具體檢測(cè)步驟如下分析：針對(duì)Alu115、247 序列上下游引物，（5’-3’）Alu115 reverse：GAG GCT GGA GCC TGT AAT C；Alu247 forward：GTGGCT CAC GCC TGT AAT；forward：CCT GAG GTCAGG AGT TCG AG；reverse：CCT GAG GTCAGG AGT TCG AG。嚴(yán)格按照說明書將引物配置為10 μmol/mL 的溶液，置于-20 ℃環(huán)境中保存。在樣品中加入100 mg/mL的2 μL RNaseA，上下游引物各為0.5 μL，均勻封膜后在室溫下放置2.5 min，以12 000 rmp 離心處理2 min。采取PCR 技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA 片段，條件為64 ℃（1 min）、95 ℃（15 s）、95 ℃（10 min），共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。將制備好的文庫(kù)和雜交試劑、封閉試劑、SureSelect 獲取探針進(jìn)行混合反應(yīng)，取連續(xù)檢測(cè)的3 次數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較全部研究對(duì)象的CTCs、cfDNA 檢測(cè)水平。（2）分析乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學(xué)特征間的關(guān)系，主要臨床特征為年齡、腫塊大小、病理類型、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分析分型、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、ER、HER-2、PR、Ki-67。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor 2, HER-2）、雌激素受體（estrogen receptor,ER）、人類細(xì)胞核抗原（Ki-67）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 CTCs、cfDNA 檢測(cè)水平分析

乳腺癌患者CTCs、cfDNA 水平均明顯高于乳腺良性疾病和健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見表1。

表1 CTCs、cfDNA 檢測(cè)水平分析量表（ ± s）

2.2 乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學(xué)特征間關(guān)系分析

乳腺癌患者外周血液中CTCs 數(shù)量和血漿cfDNA 基于Alu 序列的Alu247/115 比值與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分級(jí)、分子分型、HER-2、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移均有一定的相關(guān)性（＜0.05）；與病理類型、腫塊大小、ER、Ki-67 無相關(guān)性（＞0.05），見表2。

表2 乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學(xué)特征間關(guān)系分析量表（ ± s）

3.討論

目前，腫瘤轉(zhuǎn)移被公認(rèn)為復(fù)雜的侵襲—轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程，但是由于效率較低，僅有0.01%擴(kuò)展至循環(huán)腫瘤細(xì)胞才可形成轉(zhuǎn)移灶，有效診斷腫瘤轉(zhuǎn)移，對(duì)改善預(yù)后具有重要意義。CTCs 與乳腺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的相關(guān)研究表示，CTCs 可作為預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的輔助檢測(cè)方法。循環(huán)腫瘤細(xì)胞最早提出時(shí)間為1869 年，目前醫(yī)學(xué)界對(duì)其定義為：自實(shí)質(zhì)瘤或者轉(zhuǎn)移并早上脫落并進(jìn)入患者外周血循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，又被稱為是腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶或者循環(huán)上皮細(xì)胞，僅有少部分進(jìn)入外周血中且未被免疫系統(tǒng)識(shí)別清除的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可形成微小癌栓，通過基底膜或者血管，可在遠(yuǎn)端其中形成轉(zhuǎn)移灶。目前，已經(jīng)有大量分子生物學(xué)研究證實(shí)腫瘤早期就存在腫瘤細(xì)胞自實(shí)體瘤脫落并侵入外周血循環(huán)系統(tǒng)，且循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、動(dòng)態(tài)變化均可直接反映出病情進(jìn)展、療效。

部分研究表明，CTCs 陽性的乳腺癌患者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于陰性者；也有研究表示CTCs 可作為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展，均與CTCs 存在密切聯(lián)系。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中特異性cfDNA 片段的敏感性更高于CTCs。cfDNA 是一種從原發(fā)性腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血液循環(huán)系統(tǒng)破裂細(xì)胞釋放到外周血，造成壞死或者死亡的游離DNA，是一種特異性較強(qiáng)、靈敏度較高的腫瘤生物標(biāo)志物。CTCs、cfDNA 均可作為乳腺癌的新型液體活檢，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)療效，預(yù)測(cè)預(yù)后。

本文結(jié)果顯示，乳腺癌患者CTCs、cfDNA 檢測(cè)水平均明顯較乳腺良性疾病、健康體檢者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。乳腺癌患者外周血液中CTCs 數(shù)量和血漿cfDNA 基于Alu 序列的Alu247/115 比值與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分級(jí)、分子分型、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 均有一定的相關(guān)性（＜0.05）。表明CTCs、cfDNA 可作為乳腺癌的預(yù)測(cè)因子。將病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，以乳腺良性疾病與健康體檢者為對(duì)照，若乳腺良性疾病者CTCs-cut-off 為7.68 個(gè)/mL，則表示可達(dá)到良好的預(yù)測(cè)效果。本文結(jié)果與樊霞等研究結(jié)果一致，均證明CTCs、cfDNA 在乳腺癌的診斷中具有重要的預(yù)測(cè)效果，更有利于觀察患者病情變化，明確復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)改善機(jī)體預(yù)后具有重要意義。

綜上所述，在乳腺癌的診斷中，CTCs、cfDNA 可能為輔助診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)，cfDNA 主要檢測(cè)腫瘤DNA片段，CTCs 主要檢測(cè)腫瘤細(xì)胞。將兩項(xiàng)指標(biāo)作為乳腺癌患者病情變化與診斷的輔助診斷項(xiàng)目，可有效預(yù)測(cè)潛在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后，值得臨床應(yīng)用。