牟朋林，麥彩園，曹燕明，王 斌 (.廣州新海醫(yī)院，廣東 廣州 50080；.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 5000；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 5060；.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 5800)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是常見(jiàn)的代謝性骨疾病，其特點(diǎn)為骨量及質(zhì)量、骨強(qiáng)度下降[1]。當(dāng)前我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患者數(shù)量超過(guò)了7 000萬(wàn)，50歲以上女性患病率為20.7%[2]，OP在絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率為未絕經(jīng)女性的2～3倍[3]。OP的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)重大的健康-經(jīng)濟(jì)-社會(huì)問(wèn)題[4]。破骨細(xì)胞(OC)和成骨細(xì)胞(OB)使骨骼處于重塑狀態(tài)并維持正常的結(jié)構(gòu)與功能[5]，它們維持的平衡被打破時(shí)骨構(gòu)建功能會(huì)異常，骨質(zhì)疏松或骨代謝疾病等將發(fā)生[6]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白單鏈小分子RNA，已經(jīng)在腫瘤、骨代謝等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛研究[7]。miRNA主要通過(guò)與靶基因的3'端非編碼區(qū)結(jié)合，對(duì)靶因子產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用，導(dǎo)致其降解或停止翻譯，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡[8]。miRNA是可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向OB分化的，其對(duì)骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病的治療有重要價(jià)值[9]。史宏利等[10]分析證實(shí)miR-124-3p對(duì)BMSCs向OB的分化起調(diào)控作用。研究表明miR-328-3p、miR-338-3p可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的生物標(biāo)志物[11]。近年來(lái)，miRNA在MSCs及成骨與破骨中的生物作用越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。本研究通過(guò)RT-qPCR方法分析檢測(cè)骨組織中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及受試基本條件：本研究選擇2020年1月～2021年9月在廣州新海醫(yī)院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院招募的絕經(jīng)后婦女60例，分為對(duì)照組30例和PMOP組30例。患者傷前活動(dòng)能力、完全民事行為能力正常，無(wú)精神及認(rèn)知障礙，同意為本研究受試者，并且簽署知情同意書等相關(guān)事項(xiàng)。本研究符合人體相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到廣州新海醫(yī)院、佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。入院后登記姓名、年齡、身高、體重等各項(xiàng)資料，所有受試者檢測(cè)骨密度(BMD)及T值，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25-羥維生素D[25(OH)D]， 雌二醇。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1PMOP組入組標(biāo)準(zhǔn)：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測(cè)骨密度T值≤-2.5，診斷為PMOP。

1.2.2對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測(cè)骨密度T值≥-1.0。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重慢性疾??；引起繼發(fā)性PMOP的內(nèi)分泌性等代謝異常的疾病; 1年內(nèi)接受藥物或者激素治療；有血液系統(tǒng)疾病不能行髂前上棘骨穿刺術(shù)；難以行髂前上棘骨穿刺術(shù)取到標(biāo)本。

1.3標(biāo)本收集：所有受試者行髂前上棘骨穿刺術(shù)，取松質(zhì)骨骨組織≥300 mg，保存于液氮中，再轉(zhuǎn)深低溫冰箱(-80℃)中保存。采集空腹下外周靜脈血，離心后血清放入深低溫冰箱內(nèi)保存。

1.4方法

1.4.1主要儀器及試劑：紫外分光光度計(jì)、PCR 儀、熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物(中國(guó)Takara公司)。

1.4.2RT-qPCR過(guò)程：①取骨樣品：錘擊，加液氮研磨，勻漿，移至1 ml RNAiso Plus液的EP管，混勻，加入氯仿0.2 ml，混勻，15～30℃孵育5 min。4℃下離心15 min，將上層水相移至無(wú)RNA酶離心管中，加異丙醇，孵育10 min，于4℃下離心10 min。移去上清液，加入1 ml的75%乙醇，混勻，4℃下離心5 min后棄去上清，室溫干燥10 min。加入無(wú)RNA酶水40 μl獲得RNA溶液，用DEPC水做空白標(biāo)記，光度計(jì)檢測(cè)讀取OD比值介于1.9～2.0之間。②參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄將RNA合成cDNA：參照PCR試劑盒操作進(jìn)行，在熒光定量PCR儀(Takara)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)、Takara公司合成的引物(序列見(jiàn)表1)，反應(yīng)體系:TaqMan?Fast Advanced Master Mix(2×)10 μl,TaqMan? Advanced miRNA Assay(20×)1 μl,cDNA反應(yīng)液(1∶10 dilution)5 μl，Nuelease-free water 4 μl。按以下反應(yīng)程度反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性20 s；95℃ 1 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。選擇U6做內(nèi)參基因，使用qPCR儀自帶Rotor-Gene Q Software進(jìn)行計(jì)算所有樣品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOP組因子相比對(duì)照組因子表達(dá)變化的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1兩組人群一般資料比較：兩組人群年齡、身高、體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PMOP組患者BMD低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對(duì)照組T值>-1.0，PMOP組T值<-2.5，符合分組的規(guī)律。見(jiàn)表2。

表2 兩組人群一般資料比較

2.2兩組人群骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物比較：兩組β-CTX、PINP、雌二醇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；N-MID-OT、25(OH)D比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。符合以上指標(biāo)在對(duì)照組、PMOP組的水平變化。見(jiàn)表3。

表3 兩組人群骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物比較

2.3兩組人群骨組織中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p水平比較：PMOP組患者骨組織中的miR-124-3p、miR-338-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組，miR-328-3p表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組人群骨組織中的miRNA的相對(duì)表達(dá)值水平比較

3 討論

PMOP是由于女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平迅速下降，OC導(dǎo)致的骨吸收大大增加，而OB未相應(yīng)增加，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成引起的代謝性疾病[12]。miRNA作為一種具有調(diào)控功能的非編碼單鏈RNA大量存在于MSCs內(nèi)，影響成骨、破骨細(xì)胞的增殖、遷移和分化等多種生物學(xué)功能過(guò)程[13]。近年來(lái)，miRNA對(duì)BMSCs分化及對(duì)OB、OC的影響已成為熱點(diǎn)問(wèn)題,miR-124-3p、miR-328-3p、miR-328-3p在PMOP調(diào)控成骨和破骨中發(fā)揮一定的作用[9-10,12]。

Qadir等[14]發(fā)現(xiàn)在人BMSCs的分化過(guò)程中miR-124-3p的表達(dá)改變可能影響了BMSCs的生物學(xué)功能。miR-124-3p通過(guò)抑制GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間質(zhì)成骨[15]，RANKL降低破骨細(xì)胞形成過(guò)程中miR-124的表達(dá)，miR-124降低破骨細(xì)胞前體的增殖和活力[16]。低骨量患者中血清miR-124-3p的增高可反映骨組織對(duì)絕經(jīng)所致骨丟失的代償機(jī)制-誘導(dǎo)骨丟失，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[17]。有研究及數(shù)據(jù)庫(kù)表明miR-124-3p在成骨中的作用靶點(diǎn)可能與Wnt信號(hào)通路有關(guān)，其中的Frizzled、LRP5/6、GSK-3β、Axin為可能的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)[10,18-20]。本研究通過(guò)RT-qPCR方法分析檢測(cè)miR-124-3p在PMOP組骨組織中的表達(dá)水平降低，說(shuō)明其可通過(guò)減弱破骨、增強(qiáng)成骨促進(jìn)PMOP。miR-124-3p可能通過(guò)某些靶點(diǎn)調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松成骨、破骨分化，其作用靶點(diǎn)可能與Wnt信號(hào)通路的相關(guān)成骨因子、破骨RANKL因子有關(guān)。

Weilner等[21]研究表明miR-328-3p在骨質(zhì)疏松性骨折患者血清中顯著下降，ROC曲線分析顯示了它具有較好的診斷價(jià)值，miR-328-3p可作為PMOP發(fā)生的生物標(biāo)志物，其研究在脂肪來(lái)源的BMSCs中敲除miR-328-3p后，明顯能抑制ALP活性和礦化能力，但其靶因子及具體機(jī)制不清。有研究[15]分析MSCs能夠通過(guò)整合素吞噬凋亡小體，并利用凋亡小體來(lái)源的泛素連接酶RNF146和miR-328-3p來(lái)抑制Wnt通路的因子Axin1。缺乏凋亡的MSCs能夠同時(shí)從外源凋亡小體中吞噬RN F146和miR-328-3p并阻斷Axin1，從而影響Wnt通路。凋亡小體還轉(zhuǎn)移miR-328-3p下調(diào)MRL/lpr MSC中Axin1的表達(dá)，而敲除miR-328-3p，但不包括其他Axin靶向微RNA，能部分廢除凋亡小體的作用——對(duì)BMSCs功能受損可以起到相關(guān)作用。凋亡小體將E3連接酶RNF146和miR-328-3p轉(zhuǎn)移到MSCs中的Axin1靶點(diǎn)并激活Wnt/β-catenin通路從而減少受損干細(xì)胞。Delic等[22]發(fā)現(xiàn)miR-328-3p能直接靶向Wnt抑制蛋白SFRP1從而激活Wnt通路，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲能力，而研究表明SFRP1蛋白對(duì)OB和OC的分化均有調(diào)控作用，是調(diào)控骨重建的一個(gè)重要因子[23-24]。Ishimoto等[25]發(fā)現(xiàn)CD44是miR-328-3p的一個(gè)靶因子，有研究敲除CD44能顯著抑制OC活性[26]。本研究通過(guò)RT-qPCR方法分析檢測(cè)miR-328-3p在PMOP組骨組織中的表達(dá)水平降低，其可能通過(guò)某些靶點(diǎn)調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松成骨、破骨分化，其作用靶點(diǎn)可能與Wnt信號(hào)通路的相關(guān)因子、凋亡小體與BMSCs的相互作用有關(guān)。

研究顯示在OP中miR-338-3p 可以通過(guò)靶向于RANKL，從而抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成[27]。miR-338-3p 通過(guò)靶向作用Runx2負(fù)向調(diào)控BMSCs成骨分化,從而引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生[28]。過(guò)表達(dá)miR-338-3p明顯抑制OC活性,且使OC活性標(biāo)志物表達(dá)顯著下調(diào)[29]。本研究用RT-qPCR檢測(cè)miR-338-3p在PMOP組骨組織中的表達(dá)水平升高，說(shuō)明其可通過(guò)減弱成骨、增強(qiáng)破骨促進(jìn)PMOP，符合miR-338-3p通過(guò)影響OB和OC的靶點(diǎn)調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松成骨、破骨分化。

綜上所述，本研究miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在PMOP組骨組織中表達(dá)水平變化明顯，其可通過(guò)Wnt等靶點(diǎn)、相關(guān)因子調(diào)節(jié)成骨、破骨，影響PMOP。以上miRNA作為疾病的生物標(biāo)志物不僅具有診斷價(jià)值，而且其本身或相關(guān)因子也可能成為新藥開(kāi)發(fā)的作用靶點(diǎn)，本研究可為PMOP患者診治及研究提供相關(guān)依據(jù)。