李 毅 李文忠 師 路 高志勇 王聆宇

（西南醫(yī)科大學附屬成都三六三醫(yī)院胃腸外科，成都 610097）

結腸癌（colon cancer，CC）是人類最常見、最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中排名第二［1］。由于其發(fā)展速度快及高度轉(zhuǎn)移性，治療策略受到限制［2］。因此，急需發(fā)現(xiàn)用于早期檢測、術后監(jiān)測和管理的新型生物標志物。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一類新型的非編碼RNA，具有閉環(huán)結構且缺乏編碼潛力［3］。隨著高通量測序方法的發(fā)展，circRNAs 在各種動物組織和細胞樣品中表現(xiàn)出高豐度和高組織特異性表達［4］。重要的是，已有研究證明circRNA 失調(diào)與多種人類疾?。ㄈ缟窠?jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥）有關［5-6］。據(jù)報道，circRNA_103809 可促進肺癌發(fā)展［7］。circRNA_103809 參與調(diào)控與肝癌和結直腸癌的發(fā)生［8-9］。在既往研究中，ZHANG 等［10］發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103809在結直腸癌中下調(diào)，且與腫瘤分期和淋巴結轉(zhuǎn)移有關。然而hsa_circRNA_103809 在結直腸癌中的功能和機制尚未在體內(nèi)或體外深入研究。本文主要探究hsa_circRNA_103809 在結腸癌中的表達及circRNA_103809對結腸癌SW480細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑和4%多聚甲醛溶液（美國Invitrogen）；10%胎牛血清（FBS，美國Gibco）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美國Sigma）；CCK8試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL 發(fā)光液和DAPI 染色液（上海碧云天）；Lipo?fectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher）；SybGreenⅠ（上海捷瑞生物）；Annexin-V-PI（美國BD Pharmingen）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore）；兔抗胱天蛋白酶（caspase，cas）-3 抗體多克隆抗體（ab13847）、兔抗caspase-9 單克隆抗體（ab185719）、兔抗Bcl-2單克隆抗體兔抗（ab32124）、兔抗Bax 單克隆抗體兔抗（ab32503）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（ab205718）、HRP-兔抗小鼠IgG（ab6728）、山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488，ab150077）（英國Abcam）；小鼠抗Lamin A 單克隆抗體（#86846）、p65 單克隆抗體（#8242）（美國CST）；BD MitoScreen（JC1）試劑盒（美國BD Biosci?ences）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich）；IL-1β、IL-6和IL-4 ELISA試劑盒（美國R&D Systems 公司）；酶標儀（美國BioTek）；SmartSpec Plus 分光光度計Accuri C6 流式細胞儀（美國BD Biosciences）；ABI PRISM7500PCR 儀（美國Applied Biosystems）；光學顯微鏡（日本尼康）；LV-circRNA_103809、LV-scramble（中國廣州銳博生物）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人正常結腸上皮細胞FHC 及結腸癌細胞系HCT116、SW620、SW480和HT29均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細胞均在37 ℃、5%CO2的潮濕空氣中，在添加有10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 結腸癌患者樣品檢測 臨床獲取25例結腸癌組織樣本和癌旁組織樣本，qRT-PCR 檢測circ-RNA_103809的表達水平。

1.2.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將SW480 細胞分為對照組（不轉(zhuǎn)染），circRNA_103809 過表達組（LV-circ-RNA_103809組）及其陰性對照組（LV-scramble組）。SW480細胞（1×106個/孔）接種于6個孔板，培養(yǎng)24 h后，使用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑分別對應分組將100 nmol/L LV-circRNA_103809和LV-scramble轉(zhuǎn)染細胞。

1.2.4 CCK8 檢測細胞增殖能力 將SW480 細胞按1.2.3 分組轉(zhuǎn)染24 h，10 μl CCK8 溶液添加到平板的每個孔中。37 ℃下孵育1 h，使用酶標儀測量450 nm 處吸光度，孵育4 d，通過測量450 nm 處的吸光度評估活細胞數(shù)量。

1.2.5 qRT-PCR 檢測circRNA_103809、Ki67 和p21mRNA 的表達 根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑從結腸癌組織、癌旁組織和結腸癌細胞中提取總RNA。SmartSpec Plus 分光光度計中測量RNA 濃度和純度。A260/A280在1.8～2.0 之間表示RNA 純度高，用于進一步檢測。按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR 試劑試劑盒的說明書分別將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并制備qPCR 體系。使用ABI PRISM7500 系統(tǒng)定量，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。引物序列如下：circRNA_103809 正向引物為5'-ACGCATTCTTC?GAGACCTCT-3'，反向引物為5'-TGCCTGTAACTCCTCTTCAGT-3'；GAPDH 正向引物為5'-GAAGGT?GAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物為5'-GAAGATG?GTGATGGGATTTC-3'；Ki67 正向引物為5'-ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG-3'，反向引物為5'-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3'；p21 正向引物為5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，反向引物為5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'。將GAPDH 水平用于標準化circRNA 和mRNA 相對表達，應用2-ΔΔCt計算。每個樣品進行重復分析3次。

1.2.6 Annexin-V-FITC/PI 染色 收集按1.2.3 步驟轉(zhuǎn)染的48 h 的各組SW480 細胞，PBS 洗滌3 次，4 ℃、1 000 g 離心5 min，棄上清液，將細胞重懸于膜聯(lián)蛋白結合溶液，10μl膜聯(lián)蛋白V 懸浮。室溫下避光添加異硫氰酸熒光素（FITC）和碘化丙啶（PI）溶液。15 min后，采用流式細胞儀檢測凋亡。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析 收獲SW480 細胞并用細胞裂解緩沖液裂解以進行免疫印跡。蛋白質(zhì)（每泳道30 μg）以10%SDS-PAGE 凝膠分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。含5%牛奶Tween20（TBST）的Tris 緩沖鹽水室溫封閉膜1 h，與一抗β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase3（1∶500）、caspase9（1∶1 000）、p65（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3次后，將膜與抗兔、抗鼠IgG-HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶4 000）37 ℃孵育1 h。TBST 洗滌3 次后，使用ECL 發(fā)光液檢測免疫反應帶。

1.2.8 線粒體膜電位的測量 根據(jù)制造商的說明，使用BD MitoScreen 試劑盒評估ΔΨm 的變化。將SW480 細胞按照1.2.3 分組轉(zhuǎn)染48 h 后，收獲細胞并用PBS 洗滌2 次。然后將細胞懸浮在500 μl JC-1 工作溶液中，并在37 ℃孵育30 min。通過流式細胞儀記錄總共1×104個細胞，采用BD CFlow 軟件分析。

1.2.9 SOD 和MDA 測定 SW480 細胞按照1.2.3分組轉(zhuǎn)染48 h 后，離心獲取細胞并裂解，收集上清液，并通過BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將裂解液（35 μg）用于測定SOD 和MDA活性。

1.2.10 ELISA 檢測炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-4收集各組轉(zhuǎn)染SW480 細胞，離心10 min。收集上清液，使用ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α，每個樣品重復3次。

1.2.11 免疫熒光染色檢測NF-κBp65 的核定位將各組轉(zhuǎn)染SW480 細胞用溶于0.1%Triton100-PBS的4%多聚甲醛溶液固定20 min，5%BSA-PBS 封閉1 h。細胞與抗NF-κBp65 抗體在2%BSA-PBS 中于4 ℃孵育過夜。Alex Fluor 488 山羊抗兔IgG 的2%BSA-PBS 溶液作為二抗，避光孵育1 h。DAPI 對細胞核染色1 min，熒光顯微鏡拍攝圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均表示為至少3 個獨立實驗的±s，使用SPSS19.0 軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計分析，P<0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circRNA_103809 對結腸癌細胞增殖能力的影響 如圖1 所示，與人正常結腸組織及上皮細胞相比，結腸癌組織及各結腸癌細胞中circRNA_103809的表達顯著下調(diào)（P<0.05），選擇表達相對低的SW480 繼續(xù)實驗。與對照組相比，LV-circRNA_103809 組SW480 細胞中circRNA_103809 表達顯著上調(diào)（P<0.05），細胞活性顯著降低（P<0.05），Ki67表達顯著下調(diào)（P<0.05），p21 表達顯著上調(diào)（P<0.05），LV-scramble組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1 circRNA_103809抑制結腸癌SW480細胞增殖Fig.1 circRNA_103809 inhibits proliferation of colon can?cer SW480 cells

2.2 circRNA_103809 對結腸癌SW480 細胞凋亡的影響 如圖2 所示，與對照組相比，LV-circRNA_103809 組SW480 細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），LV-scramble 組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖2 circRNA_103809誘導結腸癌SW480細胞凋亡Fig.2 circRNA_103809 induces apoptosis of colon cancer SW480 cells

2.3 circRNA_103809 對結腸癌細胞線粒體功能的影響 如圖3所示，與對照組相比，過表達circRNA_103809降低SW480細胞線粒體膜電位，并顯著上調(diào)Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3（P<0.05）。LV-scramble組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖3 circRNA_103809 對結腸癌SW480 細胞線粒體功能的影響Fig.3 Effect of circRNA_103809 on mitochondrial func?tion of colon cancer SW480 cells

2.4 circRNA_103809 對結腸癌細胞氧化應激的影響 如圖4 所示，與對照組相比，過表達circRNA_103809減少SW480細胞中SOD含量（P<0.05），增加MDA 含量（P<0.05），LV-scramble 組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖4 circRNA_103809對結腸癌SW480細胞氧化應激的影響Fig.4 Effect of circRNA_103809 on oxidative stress of colon cancer SW480 cells

2.5 circRNA_103809 對結腸癌SW480 細胞炎癥反應的影響 如圖5 所示，與對照組相比，LV-circ-RNA_103809 組SW480 細胞上清液中IL-1β 和IL-6水平顯著降低（P<0.05），IL-4 水平顯著升高（P<0.05），SW480 細胞核中p65 表達顯著下調(diào)，免疫熒光結果顯示過表達circRNA_103809 減少p65 的細胞核定位。LV-scramble 組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖5 circRNA_103809 對結腸癌SW480 細胞炎癥反應的影響Fig.5 Effect of circRNA_103809 on inflammatory response of colon cancer SW480 cells

3 討論

結腸癌是一種惡性腫瘤，發(fā)病率高，一般認為與環(huán)境因素、遺傳因素有關［11］。結腸癌常規(guī)治療包括手術，輔助治療和分子靶向治療，但預后不理想［12-13］。因此有必要進一步研究結腸癌的發(fā)生發(fā)展及其潛在分子機制，為結腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)，以改善患者預后并減輕患者痛苦。越來越多的研究表明，circRNA 在生命過程中許多方面都發(fā)揮至關重要的作用，例如分化、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。例如circRNA-CDR1as（與小腦變性相關蛋白1轉(zhuǎn)錄物反義）可通過影響miR-7 表達參與多種癌癥生物學功能［14］。BIAN 等［8］研究表明Hsa_circRNA_103809 在大腸癌組織中的表達顯著下調(diào)，并通過miR-532e3p/FOXO4軸調(diào)控大腸癌細胞增殖和遷移。本研究結果與之一致，結果顯示circRNA_103809 在結腸癌組織與細胞中的表達較正常組織和細胞顯著降低。進一步過表達circRNA_103809，則SW480細胞活力顯著下降，Ki67 表達顯著下調(diào)，p21 表達顯著上調(diào)。因此，過表達circRNA_103809 能抑制SW480細胞增殖。

凋亡是消除癌細胞的主要機制，可以用作癌癥藥物開發(fā)研究的重要靶標［15］。本研究表明過表達circRNA_103809 可誘導SW480 凋亡，線粒體膜電位降低，促進凋亡蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 比值顯著升高。線粒體跨膜電位降低是細胞凋亡早期的不可逆事件［16］。抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2 家族，是細胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑的重要調(diào)節(jié)因子［17］。線粒體膜通透性增加，線粒體釋放細胞色素到細胞質(zhì)中，會激活cas-9，進而導致cas-3 的裂解，最終導致細胞凋亡［18］。

腫瘤治療過程中常以抗氧化酶為作用靶點，通過降低抗氧化劑（如SOD）水平導致細胞損傷和死亡而具有抗癌作用［19］。MDA 水平作為脂質(zhì)過氧化的標志物，通常用作細胞和組織中氧化損傷的標志［20］。本研究表明過表達circRNA_103809 降低SW480 細胞中SOD 水平，升高MDA 水平，通過增強氧化應激誘導細胞凋亡。

炎癥在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其不僅具有腫瘤促進劑的作用，還能通過誘導血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移而影響腫瘤發(fā)生的進程［21-22］。本研究結果表明過表達circRNA_103809 可顯著下調(diào)促炎因子IL-1β 和IL-6 表達，上調(diào)抗炎因子IL-4 表達，顯著下調(diào)NF-κB p65 表達并減少p65 的核定位。NF-κB 對許多控制各種細胞反應（例如凋亡，應激和炎癥）的靶基因發(fā)揮作用。臨床和實驗室研究表明NF-κB途徑參與多種人類疾病，例如心肌病、糖尿病腎病、白內(nèi)障和癌癥［23-26］。NF-κBp65 作為NF-κB 家族重要成員，與各種刺激、應激有關，尤其是氧化應激［27］。受刺激時，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移到細胞核中。因此circRNA_103809 通過調(diào)控NF-κBp65 的核定位抑制炎癥反應，從而阻止腫瘤發(fā)生進程。

綜上所述，circRNA_103809 在結腸癌中表達下調(diào)，并通過降低細胞增殖、誘導細胞凋亡、增強應激反應和抑制炎癥發(fā)揮抑癌功能。這些結果提示circRNA_103809可能是一種新型治療靶標。