肖 定 紀(jì)桂寶 溫松奇 鄒雯佳 胡 勇

（武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)附屬普愛(ài)醫(yī)院普通外科，武漢 430030）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種臨床較為常見(jiàn)的慢性腸道疾病，同時(shí)也是一種由多因素引起的非特異性炎癥性疾病，其病程遷延不愈，病情輕重不一。UC 主要發(fā)病于結(jié)腸黏膜或黏膜下層，常累及患者的直腸及乙狀結(jié)腸。其臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、惡心、納差、里急后重、嘔吐、發(fā)熱及營(yíng)養(yǎng)不良等，患者同時(shí)可伴有皮膚、黏膜、肝膽、眼及腸外的表現(xiàn)［1］。目前臨床上對(duì)UC 的治療主要采用藥物治療，即采用免疫抑制劑、生物制劑、糖皮質(zhì)激素及氨基水楊酸類(lèi)治療，盡管藥物的使用能夠緩解患者癥狀，但其副作用仍然明顯且無(wú)法避免復(fù)發(fā)［1］。中醫(yī)藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)療的寶貴財(cái)富，越來(lái)越多的研究表明中藥在UC的治療中發(fā)揮重要作用，特別是中藥方劑聯(lián)合西藥的中西醫(yī)結(jié)合治療方法在臨床上被廣泛應(yīng)用［2］。盡管如此，中醫(yī)藥在UC 治療領(lǐng)域仍存在很多局限。因此尋找新的、綠色的中醫(yī)藥治療方法成為中醫(yī)臨床治療UC 面臨的難點(diǎn)。為此，本研究擬探討綠色無(wú)公害食物來(lái)源中藥材大蒜衍生的類(lèi)外泌體樣納米顆粒（garlic-derived exosome-like nanoparticles，GDELN）在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中對(duì)腸道炎癥的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 5～6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠，采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法清除腸道微生物，清除后收集小鼠糞便，采用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測(cè)并細(xì)菌。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（2020-1102）。

1.2 方法

1.2.1 GDELN 的制備及鑒定 將產(chǎn)地為山東的新鮮大蒜參考文獻(xiàn)［3］方法去皮后勻漿，采用梯度離心法（500 g 10 min，2 000 g 20 min，5 000 g 30 min，10 000 g 1 h，100 000 g 2 h）離心，100 000 g 之前每次的沉淀均丟棄，收集100 000 g 后的沉淀物，用預(yù)冷的PBS重懸沉淀，參考文獻(xiàn)［4］中植物外泌體純化方法，通過(guò)8%、30%、45%及60%的梯度蔗糖離心純化，收集30%～45%的外泌體樣顆粒。電鏡檢測(cè)：將收集的GDELN 溶于含3%戊二醛及1%多聚甲醛的0.1 mol/L 的二甲胂酸鈉緩沖液，然后用含2%四氧化鋨的0.1 mol/L 的二甲胂酸鈉緩沖液固定1 h，2%醋酸鈾作用30 min 后經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇分別脫水15 min。電鏡下觀察顆粒形態(tài)。顆粒直徑分析：取純化后的納米顆粒溶于40μm濾膜過(guò)濾后的PBS，采用倍比稀釋法分析顆粒濃度，取1∶1 000 稀釋后的顆粒，采用NANOSIGHT 檢測(cè)GDELN的直徑及濃度。

1.2.2 GDELN進(jìn)入小鼠腸道后的吸收分布檢測(cè)Dir 染料標(biāo)記的2.5 mg GDELN 懸浮在0.5 ml PBS中，通過(guò)灌胃方式給予小鼠。在第0、2、4、6 小時(shí)使用珍珠脈沖成像系統(tǒng)（LI-COR Biosciences）捕獲活體圖像。16 h 后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，采集小鼠肝、肺、心、腎、胃、腸、腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、脾和腦，采用Odyssey CLX成像儀掃描GDELN在器官內(nèi)的分布。

1.2.3 結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立及GDELN 處理小鼠 5～6周齡C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分3組，8只/組，第1 天開(kāi)始3 組小鼠分別給予PBS、PBS、GDELN［2.5 mg/（只·d）］灌胃，在預(yù)處理10 d后，3組小鼠分別給予PBS、2%DSS、2%DSS+GDELN。

1.2.4 GDELN 對(duì)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、生存期及腸道炎癥的影響 從小鼠給予DSS開(kāi)始每天稱(chēng)量、記錄并分析各組小鼠體質(zhì)量，在處死小鼠前比較分析各組小鼠體質(zhì)量差異；從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始記錄每組每只小鼠生存的時(shí)間，直至其中1 組小鼠全部死亡，統(tǒng)計(jì)分析各小組的生存期；在第14 天時(shí)處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，一部分用于固定后組織切片染色，HE 及Alcian blue 染色參照參考文獻(xiàn)［5］的方法；一部分用于蛋白Array（The Common Cytokines RT2Profiler，ARY006）檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)（參照試劑盒說(shuō)明書(shū)）。

1.2.5 炎癥細(xì)胞因子及Smad信號(hào)通路的檢測(cè) 按照ELISA檢測(cè)方法提取組織蛋白，對(duì)蛋白Array篩選出的促炎細(xì)胞因子IL-8、TNF-α 和IL-6 及抑炎細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10 和IL-4 進(jìn)行一一驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)分析各細(xì)胞因子的表達(dá)差異。qPCR及Western blot 檢測(cè)結(jié)腸組織中TGF-β1 受體的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)結(jié)腸組織Smad2和Smad3的磷酸化。

1.2.6 去除腸道微生物后GDELN 對(duì)小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響 3 組小鼠飲水中分別加入氨芐青霉素鈉（1 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）、鹽酸萬(wàn)古霉素（500 mg/L）和甲硝唑（1 g/L）4 種抗生素組合連續(xù)喂養(yǎng)4 周，以完全清除小鼠腸道共生細(xì)菌。然后分別給3 組小鼠PBS、PBS、GDELN［2.5 mg/（只·d）］灌胃10 d（灌胃所用試劑及器材均為無(wú)菌），10 d 后分別給予PBS、2%DSS、2%DSS+GDELN（無(wú)菌），從給予DSS開(kāi)始，每天稱(chēng)量體質(zhì)量，在處死前比較分析各組小鼠體質(zhì)量差異。記錄每組每只小鼠的生存時(shí)間，直至其中一組小鼠全部死亡后統(tǒng)計(jì)分析各小組的生存期。第14 天處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，部分用于固定后組織切片染色，部分用于ELISA 檢測(cè)IL-8、TNF-α、IL-6、TGF-β1、IL-10 和IL-4 水平，qPCR及Western blot 檢測(cè)TGF-β1 受體表達(dá)，Western blot檢測(cè)Smad2和Smad3的磷酸化。

1.2.7 GDELN 進(jìn)入腸道后腸道微生物代謝產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)的影響 收集實(shí)驗(yàn)小鼠的糞便及結(jié)腸內(nèi)容物，以預(yù)冷的PBS溶解，然后梯度離心（500 g 10 min，2 000 g 20 min，5 000 g 30 min，10 000 g 1 h）去除沉淀，收集上清（無(wú)菌）。結(jié)腸上皮細(xì)胞株MC-38培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至85%時(shí)消化后接種至6孔板，1×105個(gè)/孔，24 h 后加入各組動(dòng)物腸道內(nèi)容物離心后的上清液，再次培養(yǎng)48 h，期間再次加入1 次代謝物上清。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí)，分別收集細(xì)胞制備RNA 和蛋白。qPCR及Western blot檢測(cè)TGF-β1表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用Graphad8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDELN 的制備、鑒定及其在體內(nèi)的內(nèi)化分布 通過(guò)梯度離心及蔗糖純化后對(duì)GDELN 的直徑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GDELN 的直徑為（156±48）nm（圖1A、B）。電鏡結(jié)果顯示，GDELN呈現(xiàn)球形（圖1C）。小鼠活體成像結(jié)果顯示，GDELN 能夠在小鼠體內(nèi)被吸收，其中肝臟、消化道比例最高（圖1D、E）。

圖1 GDELN的制備、鑒定及其在體內(nèi)的內(nèi)化分布Fig.1 Preparation and identification of GDELN and its internalization distribution in vivo

2.2 GDELN 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量及生存期的影響 GDELN 處理小鼠能顯著抑制DSS 導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量下降，與未處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2A）；此外，給予GDELN 的小鼠生存期顯著高于未給予GDELN 的小鼠（P<0.05），在DSS 組小鼠均死亡的情況下，GDELN 處理組仍未有小鼠發(fā)生死亡事件（圖2B）。

2.3 GDELN 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的影響 GDELN 處理組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于未處理組（P<0.05，圖3A），經(jīng)HE 及阿利新藍(lán)染色后觀察發(fā)現(xiàn)，GDELN 可顯著抑制DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)完整性顯著優(yōu)于未處理組（圖3B、C）。細(xì)胞因子蛋白Array 檢測(cè)結(jié)果表明，GDELN 可抑制IL-8、TNF-α 及IL-6 的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)TGF-β1 表達(dá)（P<0.05，圖3D、E）。ELISA 結(jié)果表明，GDELN 處理組小鼠IL-8、TNF-α 及IL-6 均顯著低于未處理組，而TGF-β1 顯著高于未處理組（P<0.05，圖3F）。Western blot結(jié)果則表明，GDELN處理組小鼠結(jié)腸組織中Smad2和Smad3磷酸化水平顯著高于未處理組（P<0.05，圖3G）。

圖3 GDELN對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥的影響Fig.3 Effect of GDELN on colonic inflammation in mice with DSS-induced colitis

2.4 腸道微生物對(duì)GDELN 緩解DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響 清除小鼠腸道內(nèi)菌群后，GDELN 抑制結(jié)小鼠體質(zhì)量下降的作用被消除（P<0.05，圖4A）；小鼠生存期也未得到顯著延長(zhǎng)（P<0.05，圖4B）；結(jié)腸組織染色表明，清除腸道微生物后，GDELN 無(wú)法發(fā)揮抑制腸道炎癥的作用（P<0.05，圖4C）；ELISA 結(jié)果顯示，清除腸道微生物后，GDELN 無(wú)法上調(diào)結(jié)腸組織中TGF-β1 表達(dá)，也無(wú)法抑制IL-8、TNF-α 及IL-6 表達(dá)（圖4D）；Western blot 結(jié)果顯示，清除腸道微生物后，GDELN 無(wú)法上調(diào)TGF-β1 的表達(dá)及Smad2 和Smad3 的磷酸化水平（P<0.05，圖4E）；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GDELN 處理小鼠腸道微生物的代謝產(chǎn)物能顯著上調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞MC-38 中TGF-β1 的表達(dá)（圖4F）。

圖4 去除腸道微生物后GDELN 對(duì)小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的影響Fig.4 Effect of GDELN on DSS-induced colitis in mice after removal of intestinal microorganisms

3 討論

目前UC 的病因尚不明確，但其發(fā)病機(jī)制正在被逐步破解。在過(guò)去的十幾年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究、基于微陣列的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析以及基于腸道微生物的16s 測(cè)序分析都為UC 的研究提供了新的研究方向［5-7］。由于對(duì)發(fā)病機(jī)制的逐步了解，新的治療靶點(diǎn)也在被不斷發(fā)現(xiàn)。消化系統(tǒng)每天都暴露在食源性的納米顆粒中，其中包括可食用植物來(lái)源的納米顆粒。在健康人的腸道中，免疫系統(tǒng)和微生物通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)外來(lái)抗原（包括食物源性抗原負(fù)荷及其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)）從而維持腸道的恒定平衡［8］。一旦這種平衡被打破，就可能導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。研究組在小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，食用來(lái)源的GDELN能夠降低小鼠結(jié)腸炎癥的嚴(yán)重程度，緩解小鼠體質(zhì)量下降程度，且結(jié)腸縮短程度明顯低于未給予GDELN組小鼠。提示GDELN 可能通過(guò)調(diào)控腸道免疫反應(yīng)從而調(diào)節(jié)腸道平衡抑制結(jié)腸炎癥。

研究表明，細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)腸道免疫中發(fā)揮重要作用，而在腸道免疫中的細(xì)胞因子又分為促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子［9-11］。促炎癥細(xì)胞因子主要包括IL-8、TNF-α、IL-6 等，抑炎細(xì)胞因子主要包括TGF-β1、IL-10、IL-4 等。在UC 的發(fā)生過(guò)程中，促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子的平衡失調(diào)，IL-8、TNF-α及IL-6 顯著上調(diào)，TGF-β1 顯著下調(diào)［12］。IL-8 能夠促進(jìn)PMN 進(jìn)入炎癥結(jié)腸組織，從而加重炎癥反應(yīng)［13］。TNF-α 能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板活化因子和IL-8，這些因素共同導(dǎo)致PMN、淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而遷移和外滲至結(jié)腸局部組織，引起腸道炎癥反應(yīng)［14-15］。此外，在IL-6 的參與下，TNF-α能夠誘導(dǎo)凝血酶形成，從而使內(nèi)皮細(xì)胞表面從抗凝血狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌獱顟B(tài)，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)出現(xiàn)障礙，從而降低腸道黏膜的屏障作用，促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)入腸黏膜加重腸道炎癥［16］。本研究結(jié)果表明，小鼠經(jīng)GDELN 處理后可顯著抑制DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中促炎癥細(xì)胞因子IL-8、TNF-α 及IL-6 的表達(dá)。進(jìn)一步提示GDELN 可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)從而緩解結(jié)腸的炎癥。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族中的重要成員，是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，目前的研究表明，體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均可表達(dá)并分泌TGF-β1，同時(shí)也都對(duì)該細(xì)胞因子產(chǎn)生反應(yīng)。正常情況下，腸道黏膜中高度表達(dá)TGF-β1，而TGF-β1 作為抑制炎癥的細(xì)胞因子，其功能非常強(qiáng)大，可抑制巨噬細(xì)胞的黏附和遷移，同時(shí)還能抑制T 細(xì)胞和B 細(xì)胞凋亡，抑制許多重要的炎癥介質(zhì)表達(dá)從而抑制腸道炎癥［17］。在活動(dòng)性結(jié)腸炎患者中，TGF-β1表達(dá)下調(diào)，而在UC患者中，TGF-β1 表達(dá)上調(diào)與病情緩解明顯有關(guān)［18］。TGF-β1 與其受體的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Smad2 和Smad3 的磷酸化，進(jìn)而與Smad4 形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄水平，其中就包括IL-8、TNF-α 及IL-6 等［19-22］。本研究以DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠GDELN 后，結(jié)腸組織中TGF-β1 的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著上調(diào)。

腸道黏膜穩(wěn)態(tài)是基于豐富多樣的共生細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的生理共存。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道菌群代謝物（包括細(xì)菌與膳食成分相互作用的副產(chǎn)物）均可影響腸道的免疫平衡。任何微生物的異常代謝物都能通過(guò)改變營(yíng)養(yǎng)和支持網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制，降低腸黏膜的防御能力，影響腸道免疫系統(tǒng)，進(jìn)而影響機(jī)體健康［23］。微生物群從宿主無(wú)法消化的食物成分中獲取能量，這些食物成分被代謝生成物質(zhì)，然后被宿主吸收，隨后合成為必需營(yíng)養(yǎng)素，如維生素B和K等，這個(gè)過(guò)程改變了整體能量的平衡［24］。因此，局部微生物群、腸上皮細(xì)胞和常駐免疫細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用有助于胃腸道環(huán)境的穩(wěn)定。在這個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)上皮屏障和免疫細(xì)胞正常功能發(fā)揮重要的反饋信號(hào)作用。本研究去除小鼠腸道微生物，再給予DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠GDELN 后，GDELN對(duì)腸道炎癥的緩解作用被消除，其中TGF-β1表達(dá)顯著下調(diào)，炎癥因子IL-8、TNF-α 及IL-6 表達(dá)顯著上調(diào)。提示GDELN進(jìn)入小鼠腸道后，是通過(guò)腸道微生物發(fā)揮其對(duì)腸道免疫調(diào)控作用的。研究組在收集小鼠腸道微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)腸道微生物代謝產(chǎn)物能夠上調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)GDELN 進(jìn)入腸道后，通過(guò)調(diào)控微生物代謝產(chǎn)物從而實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸炎癥的緩解。

綜上所述，本研究證實(shí)了日?？墒秤弥兴幉腉DELN 能夠顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，并通過(guò)小鼠動(dòng)物模型及細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)GDELN 通過(guò)調(diào)控腸道微生物的代謝產(chǎn)物從而上調(diào)TGF-β1 表達(dá)，進(jìn)而激活其下游的Smad2/Smad3 信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控，緩解結(jié)腸炎癥。