李國(guó)靜 張 振 趙 霞 （濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，煙臺(tái) 264100）

退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括阿爾茨海默病、帕金森氏病、脊髓損傷和亨廷頓氏癥等，近年來(lái)發(fā)病患者逐年增多，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的困擾［1-3］。越來(lái)越多的結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切地參與退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展［3-5］。研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病期間，細(xì)胞凋亡屬于正?，F(xiàn)象，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基本生理過(guò)程，退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病與β-淀粉樣蛋白有關(guān)，在體外可導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生凋亡，由于自身染色質(zhì)凝聚，膜起泡和凋亡小體等結(jié)構(gòu)變化［6］。炎癥因子中各種白細(xì)胞亞群參與退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或小膠質(zhì)細(xì)胞激活，導(dǎo)致退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥反應(yīng)增加［7-8］。因此，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷是治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的途徑之一。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long-non coding RNA，lncRNA）可調(diào)控微小RNA（microRNA，miRNA），miRNA 和蛋白質(zhì)進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用，可通過(guò)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等參與退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展［3，9］。越來(lái)越多的研究證明，MEG3、TUG1 和MALAT1 等在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮生物學(xué)作用［10-12］。miRNA 在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可通過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生［13］。目前關(guān)于miR-487a-3p 研究相對(duì)較少，因此，本研究通過(guò)不同濃度的H2O2刺激PC12 神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)MALAT1 和miR-487a-3p 相對(duì)表達(dá)量，探討MALAT1調(diào)控miR-487a-3p對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，分析其作用機(jī)制，旨在為退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的臨床治療方向和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；H2O2由江蘇凱基生物技術(shù)有限公司提供；DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶均由上海源培生物科技有限公司提供；10%胎牛血清、Lipofectamine2000 試劑盒均由美國(guó)Invitrogen 公司提供；引物由南京金斯瑞公司合成；RNA 總試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PBS、binding buffer RIPA 裂解液均由北京Solarbio 公司提供；Annexin V-FITC、PI 均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH 抗體均由美國(guó)Abcam 公司提供；TNF-α、IL-6、IL-1β 試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將大鼠神經(jīng)細(xì)胞PC12置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每2 d換1次培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞密度融合至70%～80%時(shí)，使用0.25%胰酶消化，離心棄上清，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞，按照3×104個(gè)/孔接種到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度融合至75%時(shí)，按照Lipofectamine2000 試劑盒將si-NC、si-MALAT1、miR-NC、miR-487a-3p、anti-miR-NC 和miR-487a-3p 轉(zhuǎn)染至PC12 細(xì)胞，以200 μmol/L H2O2進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組H2O2濃度為0 μmol/L 進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，收集PC12細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)MALAT1 和miR-487a-3p 表達(dá) 收集各組PC12 細(xì)胞，PBS 洗滌，采用試劑盒提取總RNA，并檢測(cè)RNA 濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將合成cDNA 為模板進(jìn)行qRTPCR。MALAT1 正向引物為5'-GGCGGAATTGCTG?GTAGTTT-3'，反向引物為5'-AGCATAGCAGTA?CACGCCTT-3'；GAPDH 正向引物為5'-GGTT?GTCTCCTGCGACTTCA-3'，反向引物為5'-TGGTC?CAGGGTTTCTTACTCC-3'；U6 正向引物為5'-CTC?GCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為 5'-AAC?GCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-487a-3p 正向引物為5'-GGCGAATCATACAGGGACATC-3'，反向引物為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MALAT1和miR-487a-3p表達(dá)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，采用PBS 洗滌，加入binding buffer重懸懸浮細(xì)胞，待充分混勻后，再加入10μl的Annexin V-FITC和5μl PI溶液，使其充分混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，PBS 洗滌2 遍，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，冰浴20 min 震碎細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取總蛋白。經(jīng)凝膠電泳處理細(xì)胞后，轉(zhuǎn)膜，加入一抗稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜孵育，再加入二抗孵育，室溫孵育2 h，使用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，棄上清，按照TNF-α 試劑盒、IL-6 試劑盒和IL-1β試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其含量。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MALAT1和miR-487a-3p靶向關(guān)系 采用在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)MALAT1 和miR-487a-3p 的3'UTR 端存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，然后構(gòu)建MALAT1 的野生型（MALAT1-WT）和突變型（MALAT1-MUT）報(bào)告載體，分別于miR-NC 和miR-487a-3p 共轉(zhuǎn)染至PC12 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后使用熒光素酶試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2對(duì)MALAT1表達(dá)的影響 如表1所示，隨著H2O2的增加，MALAT1的相對(duì)表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性增加，其中，H2O2濃度為200μmol/L 時(shí)，效果較為明顯。

2.2 不同濃度H2O2對(duì)miR-487a-3p 的表達(dá)影響如表2 所示，隨著H2O2濃度的增加，miR-487a-3p 的相對(duì)表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性降低，其中，H2O2濃度為200 μmol/L 時(shí)，效果較為明顯。因此，綜合表1 結(jié)果，選擇H2O2濃度為200μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度H2O2下MALAT1的表達(dá)Tab.1 Expressions of MALAT1 at different concentra?tions of H2O2

表2 不同濃度H2O2下miR-487a-3p的表達(dá)Tab.2 Expressions of miR-487a-3p at different concentra?tions of H2O2

2.3 抑制MALAT1 的表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與Control組相比，H2O2組MALAT1表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；與H2O2+si-NC 組相比，H2O2+si-MALAT1 組MALAT1表達(dá)量明顯降低（圖1A，P<0.05）。如圖1B～F所示，與Control 組相比，H2O2組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與H2O2+si-NC組相比，H2O2+si-MALAT1 組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。

圖1 抑制MALAT1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.1 Effects of inhibiting expressions of MALAT1 on H2O2-induced neuronal apoptosis and inflammatory factors

2.4 過(guò)表達(dá)miR-487a-3p 對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示如圖2A所示，與Control 組相比，H2O2組miR-487a-3p 表達(dá)量明顯升高；與H2O2+miR-NC 組相比，H2O2+miR-487a-3p組miR-487a-3p 表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。如圖2B～F 所示，與Control 組相比，H2O2組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與H2O2+miR-NC組相比，H2O2+miR-487a-3p 組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-487a-3p對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR-487a-3p on H2O2-induced neuronal apoptosis and inflammatory factors

2.5 MALAT1 靶向miR-487a-3p 如圖3 所示，通過(guò)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)了MALAT1 與miR-487a-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1 與miR-487a-3p 靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC 相比，miR-487a-3p 組野生型MALAT1-WT熒光酶活性明顯降低（P<0.05），而MALAT1-MUT熒光酶活性無(wú)明顯變化（表3）。表4 結(jié)果顯示，與pcDNA 組相比，過(guò)表達(dá)MALAT1組NEAT1表達(dá)水平顯著升高。表5結(jié)果顯示，與pcDNA組相比，過(guò)表達(dá)MALAT1 組明顯降低miR-487a-3p 表達(dá)水平（P<0.05）；與si-NC 比較，抑制MALAT1 明顯升高miR-487a-3p表達(dá)水平（P<0.05）。

表3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)（±s）Tab.3 Double luciferase assay（±s）

表3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)（±s）Tab.3 Double luciferase assay（±s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MALAT1-MUT 1.04±0.06 1.01±0.04 0.721 0.511 Groups miR-NC miR-487a-3p tP MALAT1-WT 0.99±0.07 0.43±0.041）12.031 0.230

表4 過(guò)表達(dá)MALAT1的轉(zhuǎn)染效率（±s）Tab.4 Transfection efficiency of overexpression of MALAT1（±s）

表4 過(guò)表達(dá)MALAT1的轉(zhuǎn)染效率（±s）Tab.4 Transfection efficiency of overexpression of MALAT1（±s）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

NEAT1 1.03±0.05 3.45±0.261）15.831 0.000 Groups pcDNA MALAT1 tP

表5 MALAT1調(diào)控miR-487a-3p的表達(dá)（±s）Tab.5 MALAT1 regulates expression of miR-487a-3p（±s）

表5 MALAT1調(diào)控miR-487a-3p的表達(dá)（±s）Tab.5 MALAT1 regulates expression of miR-487a-3p（±s）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-487a-3p 1.07±0.08 0.52±0.041）0.98±0.05 3.31±0.282）210.943 0.000 Groups pcDNA MALAT1 si-NC si-MALAT1 FP

圖3 MALAT1與miR-487a-3p結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Binding site of MALAT1 and miR-487a-3p

2.6 抑制miR-487a-3p 可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1 對(duì)H2O2細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)如圖4結(jié)果顯示，與Control組相比，H2O2組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與H2O2+si-NC 組相比，H2O2+si-MALAT1 組凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與H2O2+si-MALAT1+anti-miR-NC組相比，H2O2+si-MALAT1+miR-487a-3p組的凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。

圖4 抑制miR-487a-3p 可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1 對(duì)H2O2細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.4 Inhibition of miR-487a-3p reverses effects of MALAT1 inhibition on H2O2 cell apoptosis and inflammatory factors

3 討論

退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病主要是由神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能喪失引起的認(rèn)知和行為障礙一類(lèi)疾病的統(tǒng)稱(chēng)，近年來(lái)，隨著我國(guó)老齡化發(fā)展迅速，我國(guó)將成為全球退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率最高、增長(zhǎng)速度最快的國(guó)家［14］。細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的主要原因，神經(jīng)細(xì)胞在受到炎癥因子白細(xì)胞亞群刺激后，引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而破壞神經(jīng)細(xì)胞功能［8］。PC12 大鼠細(xì)胞是一種形態(tài)和結(jié)構(gòu)等與神經(jīng)元較為相似的一種細(xì)胞系，多被研究報(bào)道用于神經(jīng)細(xì)胞功能研究［15］。劉旭東等［16］研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)水平降低，凋亡率增加，這與本研究結(jié)果相似。本研究中，用H2O2處理PC12 細(xì)胞后，凋亡率、促凋亡蛋白Bax 和TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平增加，抑凋亡蛋白Bcl-2 降低，說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，表明模型構(gòu)建成功。

近年來(lái)，關(guān)于lncRNA 和miRNA 相互作用的研究不斷深入，ZHAO 等［17］研究結(jié)果表明，ANRIL 通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-7來(lái)減輕H2O2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的氧化損傷、細(xì)胞活力和凋亡，可能與激活mTOR 和MEK/ERK 信號(hào)通路有關(guān)。LI 等［18］在研究脊髓損傷中的結(jié)果顯示，通過(guò)下調(diào)ANRIL可增加H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷，ANRIL 可靶向調(diào)控miR-125a 表達(dá)，干擾miR-125a可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)ANRIL對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的作用。SUN 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理神經(jīng)細(xì)胞后，下調(diào)EPIC1 的表達(dá)，沉默EPIC1 可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧或炎癥因子處理腫瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)H19和HULC 存在差異表達(dá)，進(jìn)行H2O2短期氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激細(xì)胞系后，H19 和HULC 通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［20］。下調(diào)MALAT1 可增加H2O2誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡、凋亡和氧化應(yīng)激水平，這與本研究結(jié)果相似［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理調(diào)神經(jīng)細(xì)胞后，下調(diào)MALAT1的表達(dá)，這與SUN 等［19］的研究結(jié)果相似；另外，抑制MALAT1的表達(dá)可明顯降低H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax 和TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平增加，抑凋亡蛋白Bcl-2降低，這說(shuō)明抑制MALAT1的表達(dá)可緩解H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。目前，miR-137-3p、miR-422a、miR-9a-5p、miR-146a、miR-34a-5p 等參與H2O2處理PC12 細(xì)胞后引起的細(xì)胞損傷，分析其主要原因可能與細(xì)胞活力、凋亡率、氧化應(yīng)激水平等有關(guān)［22-26］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理PC12 細(xì)胞后，上調(diào)miR-146a 的表達(dá)，且miR-146a靶向調(diào)控SOD2 的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相反［25］。miR-487a-3p 已在胰腺癌、前列腺和腎癌等腫瘤中報(bào)道，關(guān)于miR-487a-3p在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究相對(duì)較少［27-29］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理PC12細(xì)胞后，miR-487a-3p表達(dá)下調(diào)，且過(guò)表達(dá)的miR-487a-3p可明顯降低細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，這說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-487a-3p可緩解H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，MALAT1可以靶向負(fù)調(diào)控miR-487a-3p，抑制miR-487a-3p 的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1 對(duì)H2O2細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，這說(shuō)明，MALAT1 通過(guò)調(diào)控miR-487a-3p 的表達(dá)可減緩H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，MALAT1在H2O2處理PC12細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制MALAT1 表達(dá)可以緩解H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其作用可能與靶向負(fù)調(diào)控miR-487a-3p有關(guān)，為臨床進(jìn)一步研究退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供合理的依據(jù)。