高建華 葉小磊 郭瑩葉 方義湖 （江西醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，上饒 334000）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層，具有向多種組織細(xì)胞分化和再生的能力。MSCs來(lái)源廣泛，可以通過(guò)多種途徑獲得，如人自體脂肪、牙髓、骨髓、臍帶、羊膜及胎盤(pán)等［1］。目前MSCs 研究主要集中在其多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)方面，研究表明MSCs 對(duì)T 細(xì)胞的增殖、分化有直接抑制作用，MSCs 也可通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的分化和成熟，從而間接抑制T 細(xì)胞的增殖和效應(yīng)T 細(xì)胞亞群的分化［2］；1995 年MSCs 首次應(yīng)用于臨床研究，2012 年首個(gè)MSCs 產(chǎn)品獲得加拿大FDA 批準(zhǔn)上市，用于治療對(duì)免疫抑制劑不敏感的重癥急性移植物抗宿主疾?。╣raft-versus-host-disease，GVHD）患者，結(jié)果證實(shí)同種異源的MSCs 用于治療GVHD具有較好的安全性和有效性［3］。

目前MSCs 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為MSCs 通過(guò)細(xì)胞間的相互接觸和分泌一些可溶性因子來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用。IL-33 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，在包括過(guò)敏性疾?。ㄏ?、自身免疫性疾病（類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、心血管疾病（心力衰竭）和神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ。┑榷喾N疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用［4］。IL-33 隸屬于IL-1 家族（interleukin-1 family，IL-1F），通常由受損或壞死的屏障細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞）釋放，在與外界接觸的黏膜組織如呼吸道、消化道等有較高的表達(dá)量，充當(dāng)免疫示警信號(hào)［5］；在炎癥刺激時(shí)，IL-33 在這些屏障細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)結(jié)合另外一些細(xì)胞因子如IL-25、胸腺基質(zhì)淋巴蛋白參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，在先天免疫、炎癥和過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)，在人臍帶中存在高水平的IL-33，但其功能不明［6］。本研究通過(guò)分離培養(yǎng)臍帶來(lái)源的MSCs，檢測(cè)IL-33 表達(dá)水平，并使用慢病毒shRNA 基因沉默技術(shù)，穩(wěn)定下調(diào)IL-33在MSCs中的表達(dá)來(lái)探討IL-33對(duì)MSCs增殖和抗凋亡生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 MSCs 購(gòu)自浙江如耀生物科技有限公司，來(lái)自人類(lèi)臍帶分離物；MSCs 培養(yǎng)基來(lái)自美國(guó)Stem cell 公司（Lonza，貨號(hào)：12-725F）；胎牛血清來(lái)自美國(guó)HyClone 公司；轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENETMHP購(gòu)自Roche 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Life Technolo‐gies 公司；cDNA 合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀為美國(guó)ABI attune 產(chǎn)品；抗人IL-33、β-actin、AKT以及AKT磷酸化抗體形式（Ser473）抗體、Caspase-3 Antibody、Cleaved Cas‐pase-3、Bcl-2、Bax、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗均為美國(guó)Cell signaling technology 產(chǎn)品；IL-33重組蛋白購(gòu)自上海近岸生物科技有限公司；血清替代物購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司（Pall，貨號(hào)：15950-017）；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技有限公司；293T細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 設(shè)計(jì) 查閱NCBI 網(wǎng)站，獲取IL-33的mRNA 序列，再應(yīng)用shRNA 在線軟件設(shè)計(jì)shRNA特異性序列，見(jiàn)表1。同時(shí)采用與IL-33 mRNA 沒(méi)有同源性的shRNA 作為對(duì)照（sh Scarmble），委托蘇州金唯智公司進(jìn)行目標(biāo)序列的合成。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MSCs 培養(yǎng)在37℃、含5%CO2飽和濕度的環(huán)境中，使用含有血清替代物、氨芐青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）的MSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基；每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)接觸層疊時(shí)按1∶3 的比例進(jìn)行傳代；用含有10%胎牛血清和青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，其傳代與復(fù)蘇方法跟MSCs培養(yǎng)相似。

1.2.3 RT-PCR 用RT-PCR 檢測(cè)IL-33 mRNA 在不同細(xì)胞系的表達(dá)量。提取各組細(xì)胞總RNA 后，用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV獲取mRNA的cDNA。IL-33引物設(shè)計(jì)以及反應(yīng)體系如下：IL-33 引物為hIL33-F：5'-

TGTGGAGTGCTTTGCCTTTG-3'，hIL33-R：5'-CAT‐CAACACCGTCACCTGATTC-3'；以GAPDH 基因作為內(nèi)參，各組cDNA作為模板，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：500 ng 模板cDNA，各0.2 μl 正反向引物，12.5 μl 熒光定量PCR MasterMix，ddH2O 補(bǔ)足至25 μl，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫印跡法 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，吸取培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于冰上，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，吸出剩余的PBS，在冰上用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，然后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，吹打裂解物以破壞DNA。取3 μl 進(jìn)行BCA 定量，剩余樣本中添加上樣緩沖液后，95 ℃孵育5～10 min 變性，儲(chǔ)存于?20℃冰箱中。準(zhǔn)備10%SDS-PAGE 凝膠，每孔加入40 μg 蛋白，電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，再加入β-actin 內(nèi)參抗體并在室溫下孵育1 h，用TBST 洗滌3 次，棄掉TBST；加入二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次，棄掉TBST，在蛋白成像儀中顯影定量。

1.2.5 IL-33 shRNA 載體構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ在37 ℃下酶切載體pLKO-GFPTRC 1 h；將其與退火后的shRNA 相混合，22 ℃T4連接酶連接3 h，再加入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化，挑選出單克隆菌群，37 ℃300 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取菌液質(zhì)粒，并測(cè)定其純度；用核酸內(nèi)切酶XhoⅠ37 ℃下酶切空載體和IL-33 shRNA 載體1 h，取4 μl 酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒送蘇州金唯智公司測(cè)序驗(yàn)證。用含10%的胎牛血清、氨芐青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，使用0.25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)前2 h，將DMEM 培養(yǎng)基換成MEM 培養(yǎng)液；將2.5 μg IL-33 shRNA 載體、pCMV-dR8.91 和pCMV-VSV-G 均勻混合，加入10 μl X-treme GENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑，sh Scarmble組和GFP組設(shè)為對(duì)照，室溫下靜置20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物培養(yǎng)24～48 h 后，收集上清液，并將其加入MSCs培養(yǎng)液中，用1 μg/ml的嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選，免疫印跡檢測(cè)IL-33 在shIL-33 組、sh Scarmble 組和GFP 對(duì)照組中的表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 選取3 組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSCs 細(xì)胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，待細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底后，使用MTT 法進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)6 d，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用流式細(xì)胞儀對(duì)MSCs 特征性表達(dá)分子和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。收集正常MSCs，分別用不同的熒光抗體標(biāo)記檢測(cè)MSCs 特征性蛋白的表達(dá)水平。收集shIL-33 和sh Scramble 的MSCs，當(dāng)細(xì)胞的覆蓋率達(dá)70%～80%時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化。2 000 r/min 離心5 min，棄上清液，稀釋細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/ml。PBS 洗滌2 次后，用400 μl緩沖液重懸細(xì)胞。加入Annexin V FITC 染液5 μl，室溫孵育10 min，再加入PI 染液5 μl，4 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析。

1.2.8 外源性IL-33對(duì)shIL-33 MSCs細(xì)胞凋亡的影響 在shIL-33 組中補(bǔ)充重組蛋白IL-33，終濃度為60 pg/ml，5 d 后，采用1.2.7 的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染色，檢測(cè)細(xì)胞增殖相對(duì)水平變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較用ANOVA 檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行表型分析 如圖1 所示，MSCs 在鏡下形態(tài)均一，背景干凈，培養(yǎng)過(guò)程中增殖速度穩(wěn)定，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。采用熒光標(biāo)記抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)培養(yǎng)的MSCs 進(jìn)行表型分析，結(jié)果如圖1B 所示，CD29 以及CD105 指標(biāo)均為陽(yáng)性，所占比例分別為75%和80%，CD34、CD45以及HLA-DR均為陰性，提示所培養(yǎng)的MSCs純度較高，可用于后續(xù)的研究。

圖1 MSCs形態(tài)圖及流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs純度Fig.1 Morphology of MSCs and evaluation purity of MSCs by flow cytometry

2.2 IL-33 在MSCs 中的表達(dá)水平 通過(guò)RT-PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的幾個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行IL-33 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)，如圖2 所示，IL-33 在MSCs 中為高表達(dá)，顯著高于其他幾個(gè)細(xì)胞株，包括H1299（人肺癌細(xì)胞），HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）以及THP-1 細(xì)胞（人單核巨噬細(xì)胞）。

圖2 在不同細(xì)胞株中IL-33 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression of IL-33 mRNA in different cells

隨后構(gòu)建3 個(gè)用于慢病毒包裝的shRNA 載體，得到大量的陽(yáng)性克隆如圖3A 所示。得到克隆進(jìn)行菌液的測(cè)序分析，結(jié)果如圖3B 所示，提示構(gòu)建的shRNA序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致。

圖3 IL-33 shRNA沉默載體構(gòu)建Fig.3 Construction of IL-33 shRNA silencing vectors

2.3 IL-33 包裝慢病毒的感染效率 將IL-33 特異性基因shRNA 克隆到pLKO 質(zhì)粒載體中，再用慢病毒進(jìn)行包裝，48 h后，收集培養(yǎng)上清液中的慢病毒并用于感染靶細(xì)胞，將pLKO-sh Scramble 載體用作對(duì)照，如圖4 所示，從熒光結(jié)果來(lái)看，細(xì)胞的感染率約為90%。

圖4 MSCs 感染shIL-33 慢病毒后在顯微鏡下的明場(chǎng)（BF）和綠色熒光（FL）圖像Fig.4 Brightfield （BF） and green fluorescence （FL）images of MSCs after infection with shIL-33 lentivirus under a microscope

2.4 IL-33 穩(wěn)定沉默對(duì)蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，shIL-33 組與pLKO 組相比，IL-33 表達(dá)顯著降低。如圖5 所示，設(shè)計(jì)的shRNA 都不同程度上沉默IL-33 表達(dá)，其中shRNA3 沉默效果最好，其敲除效率可以達(dá)到95%，說(shuō)明通過(guò)慢病毒技術(shù)構(gòu)建的shRNA 載體能高效抑制MSCs 中IL-33 的表達(dá)，選擇shRNA3感染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 免疫印跡檢測(cè)慢病毒感染MSCs后IL-33的蛋白表達(dá)Fig.5 Expression level of IL-33 in infected-MSCs was detected by immunoblotting

2.5 IL-33 穩(wěn)定沉默對(duì)MSCs 增殖能力的影響 通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線來(lái)評(píng)估沉默IL-33對(duì)MSCs增殖的影響，結(jié)果如圖6A 所示，與pLKO 組相比，IL-33 干擾后的MSCs 的增殖速度在第4 天和第5 天顯著變慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在第6天時(shí)與pLKO 組水平持平。采用免疫印跡探究Ki-76 水平的變化，結(jié)果如圖6B 所示，與pLKO 組相比，IL-33干擾后的MSCs 的Ki-76 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 沉默IL-33對(duì)MSCs增殖影響Fig.6 Effects of IL-33 silencing on MSCs proliferation

2.6 IL-33 穩(wěn)定沉默對(duì)MSCs 凋亡的影響 采用Annexin V/PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖7 所示，shIL-33組中的凋亡水平顯著高于pLKO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖7 沉默IL-33對(duì)MSCs凋亡的影響Fig.7 Effect of silencing IL-33 on apoptosis of MSCs

2.7 IL-33 穩(wěn)定沉默對(duì)MSCs 凋亡相關(guān)蛋白的影響 采用免疫印跡探究IL-33 穩(wěn)定沉默MSCs 后對(duì)凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的影響。結(jié)果如圖8 所示，shIL-33 組中的促凋亡蛋白Bax 和Cleaved Caspase-3 水平高于pLKO 組，而抗凋亡相關(guān)基因蛋白Bcl-2 低于pLKO 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖8 沉默IL-33對(duì)MSCs中凋亡蛋白的影響Fig.8 Effect of silencing IL-33 on apoptosis protein in MSCs

2.8 IL-33穩(wěn)定沉默對(duì)MSCs增殖相關(guān)蛋白的影響

采用免疫印跡進(jìn)行增殖相關(guān)蛋白AKT 及其磷酸化形式分析，結(jié)果如圖9 所示，AKT 磷酸化在沉默IL-33 后被顯著抑制，給予重組IL-33 蛋白（rhIL-33）后，磷酸化ser473 的水平可以恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖9 IL-33沉默對(duì)總AKT和AKT磷酸化的影響Fig.9 Effect of IL-33 silencing on total AKT and AKT phosphorylation

2.9 補(bǔ)充IL-33 對(duì)MSCs 增殖和凋亡的影響 補(bǔ)充rhIL-33，檢測(cè)其對(duì)MSCs 增殖和凋亡的影響，結(jié)果如圖10 所示，MSCs 的相對(duì)增殖速度在補(bǔ)充rhIL-33 后得到恢復(fù)，相對(duì)凋亡水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖10 補(bǔ)充rhIL-33對(duì)MSCs增殖和凋亡的影響Fig.10 Effect of rhIL-33 supplementation on prolifera?tion and apoptosis in MSCs

3 討論

MCSs作為免疫系統(tǒng)“安全信號(hào)”的來(lái)源，具有較好的免疫抑制效應(yīng)，已有臨床研究開(kāi)始使用MSCs治療移植物抗宿主病、克羅恩病和骨關(guān)節(jié)炎等免疫介導(dǎo)的疾病，然而對(duì)MSCs 免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。初步研究顯示，MSCs不僅可對(duì)多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生直接的作用還可以分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子影響免疫功能，如IL-10、IL-6、TGF-β、CCL-2、CCL-5、IDO、VEGF、ICAM、PGE2 等［7］。IL-33 是細(xì)胞因子IL-1 超家族的新成員，主要由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，在促炎刺激后其表達(dá)上調(diào)，IL-33既可以作為傳統(tǒng)的細(xì)胞因子，也可以作為調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的核因子［8］。本研究檢測(cè)了臍帶來(lái)源的MSCs中IL-33 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IL-33 在基因和蛋白水平均存在高表達(dá)，不需要通過(guò)炎癥因子刺激。也有文獻(xiàn)顯示，IL-33/ST2 信號(hào)通路在健康妊娠和胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用，表達(dá)下降可導(dǎo)致子癇前期孕婦滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常［9］。這說(shuō)明IL-33在臍帶來(lái)源MSCs天然分泌，并對(duì)妊娠期間相關(guān)細(xì)胞正常生理功能的維持具有重要意義。

早期研究認(rèn)為，IL-33主要作為炎癥警告蛋白在炎癥中發(fā)揮重要作用，但近年研究發(fā)現(xiàn)IL-33 還與細(xì)胞增殖、凋亡息息相關(guān)，IL-33 可以通過(guò)抑制cas‐pase-3的裂解，減少細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活［10］。CHEN 等［11］發(fā)現(xiàn)通過(guò)注射高表達(dá)IL-33 的MSCs可明顯改善心肌梗死大鼠的心功能，減輕炎癥反應(yīng)，表明了IL-33 在心臟病中的心臟保護(hù)作用。再者，IL-33還可以促進(jìn)小鼠肥大細(xì)胞的增殖［12］。在干細(xì)胞相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，IL-33可以影響部分干細(xì)胞的存活、增殖和分化，IL-33 可顯著促進(jìn)骨髓中的骨髓造血干細(xì)胞的生成和髓樣細(xì)胞遷移［13］。IL-33可刺激牙髓干細(xì)胞增殖和克隆形成［14］。為進(jìn)一步了解IL-33 對(duì)MSCs 增殖和凋亡的影響，本課題組使用了慢病毒載體來(lái)穩(wěn)定沉默細(xì)胞中IL-33 的表達(dá)，結(jié)果顯示，IL-33穩(wěn)定沉默后細(xì)胞的增殖速度明顯降低，凋亡率明顯增加。而補(bǔ)充外源性IL-33 重組蛋白后則恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力。這些結(jié)果提示，IL-33對(duì)MSCs 增殖有明顯的促進(jìn)作用，并可使細(xì)胞具備較強(qiáng)的存活和抗凋亡能力。

IL-33 通過(guò)與ST2 結(jié)合后，可誘導(dǎo)ERK1/2、JNK、p38 和PI3K/AKT 等信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化，繼而導(dǎo)致前致炎因子釋放、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，與多種急、慢性炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病有關(guān)。研究表明，IL-33 可以通過(guò)影響巨噬細(xì)胞極化提高M(jìn)SCs 的免疫調(diào)節(jié)能力，其潛在機(jī)制可能是IL-33 通過(guò)誘導(dǎo)AKT 磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，減少M(fèi)SCs 的凋亡［15-16］。AKT 也稱(chēng)為蛋白激素酶B，是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，對(duì)于細(xì)胞存活和凋亡至關(guān)重要［17］。在干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，AKT 的活化可通過(guò)抑制GSK3β 抑制多能干細(xì)胞的凋亡，通過(guò)小分子抑制劑抑制AKT活性后可誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡的發(fā)生［18］。同時(shí)有研究顯示，IL-33 可以通過(guò)ST2 非依賴(lài)性途徑顯著抑制GSK3β 的活化，從而活化PI3K/AKT 通路［19］。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了AKT 及其磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs 中沉默IL-33 后，AKT 磷酸化（ser473）水平也明顯下調(diào)，而給予shIL-33 后，AKT 磷酸化水平可以恢復(fù)，該結(jié)果表明，IL-33 在穩(wěn)定AKT 磷酸化水平中可能發(fā)揮重要作用，AKT通路的活化可能是IL-33調(diào)節(jié)MSCs 增殖、凋亡的關(guān)鍵機(jī)制。同時(shí)，最新的研究表明，在促炎條件下，IL-33 表達(dá)水平的變化被認(rèn)為是預(yù)測(cè)器官損傷和異體器官移植的生物標(biāo)志［20］。另有研究表明，通過(guò)一定的遞送手段，傳遞或阻斷IL-33是一種有效的治療策略，可以維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，預(yù)防感染性和炎癥性疾病［21］。鑒于本研究發(fā)現(xiàn)IL-33 能夠調(diào)節(jié)MSCs 的增殖和凋亡，猜測(cè)IL-33可能對(duì)MSCs 介導(dǎo)的組織愈合、器官移植等具有重要的調(diào)節(jié)作用，繼續(xù)深入探討其在MSCs 中的功能和機(jī)制，將是下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究使用慢病毒技術(shù)穩(wěn)定沉默IL-33在MSCs中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MSCs的增殖能力明顯減弱，細(xì)胞凋亡比例明顯增高，而外源性重組IL-33 則能恢復(fù)細(xì)胞增殖；IL-33 沉默后AKT 磷酸化水平顯著下調(diào)，說(shuō)明IL-33 可能與MSCs 增殖、凋亡有關(guān)，并通過(guò)調(diào)節(jié)AKT磷酸化來(lái)發(fā)揮其作用。