李詠紅 張軼強(qiáng) 向 丹 張玉沛 （荊門市中醫(yī)醫(yī)院肺病科，荊門 448002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由有毒物質(zhì)吸入、肺炎、藥物中毒等肺內(nèi)或肺外原因引起的以彌漫性肺泡損傷為主要特點(diǎn)的肺組織疾病，因其高發(fā)病率及高病死率而備受關(guān)注［1-2］。ARDS 發(fā)病急、難控制、預(yù)后差，常引發(fā)多器官受累，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，為避免ARDS 發(fā)展，需要及時(shí)干預(yù)治療，因此開發(fā)可保護(hù)肺組織結(jié)構(gòu)的藥物對(duì)ARDS 治療具有重要指導(dǎo)價(jià)值［3-4］。烏司他丁是從人尿液中提取的能抑制多種酶活性的糖蛋白，具有抗炎、抗氧化等多種生理活性，近年研究指出烏司他丁可一定程度緩解肺損傷，BAO 等［5］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁對(duì)肺癌患者因放療引發(fā)的急性肺損傷具有一定治療作用；徐彥立等［6］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能有效改善ARDS 患者氧代謝、肝腎功能等，具有降低患者體內(nèi)炎癥因子表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫功能等作用，對(duì)ARDS 具有較好治療效果，但作用機(jī)制尚不明確。激活的脂氧素A4 受體（lipoxin A4 receptor，ALX）/環(huán)磷酸腺苷（cyclicosine mono‐phosphate，cAMP）/磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）/Nedd4 通路與ARDS 密切相關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）、鈉/鉀-ATP酶（Na/K-adenosine triphosphatase，Na/K-ATPase）等表達(dá)促進(jìn)肺泡液體清除［7］。但關(guān)于烏司他丁對(duì)ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路影響的研究較少。本研究通過建立ARDS 大鼠模型，研究烏司他丁對(duì)肺泡清除率及ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路的影響，初步探究烏司他丁的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只7月齡SPF級(jí)成年健康雄性SD 大鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量（230±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0002。所有大鼠均于荊門市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度約25 ℃，相對(duì)濕度約50%，噪音低于80分貝，自然光照，自由飲食進(jìn)水，每天更新飲用水及食物，每周清潔1次鼠籠及更換墊料。

1.1.2 主要試劑及儀器 烏司他?。║873326，上海麥克林生化科技有限公司）；脂多糖（LPS，L8880）、TNF-α（SEKM-0034）、IL-6（SEKM-0007）、IFN-γ（SEKM-0031）ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；HE 染色試劑盒（E607218-0200，上海生工公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（P0027、P0011，上海碧云天公司）；ENaC（ab214192）、ALX（ab181101）、p-Akt（ab8805）、cAMP（ab134901）、Nedd4（ab236512）、Na/K-ATPase（ab254025）、GAPDH（ab8245）兔抗鼠一抗、羊抗兔IgG（ab150077，Abcam 公司）；ABL90 血?dú)夥治鰞x（上海雷度米特醫(yī)療設(shè)備有限公司）；PUZS-300 全自動(dòng)生化分析儀（上海帝博思生物科技有限公司）；XElx800 酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司）；RM2125RTS 手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；SMZ745 光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)膜儀、1659001 蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；GIS-500 凝膠成像儀（Miulab公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 45 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、烏司他丁低（25 000 U/kg）、中（50 000 U/kg）、高（100 000 U/kg）劑量組，每組9 只。模型組及烏司他丁各劑量組采用暴露式氣管滴注LPS 法制備ARDS 大鼠模型：將大鼠麻醉后持仰臥位固定于約50°的斜板上，碘伏清潔大鼠頸部皮膚并切開使頸部氣管暴露，氣管滴注LPS溶液（溶于生理鹽水，3 mg/kg），翻轉(zhuǎn)大鼠使LPS 溶液在肺內(nèi)均勻分布，測(cè)定大鼠動(dòng)脈氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（PaO2/FiO2），大鼠出現(xiàn)呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)、口唇發(fā)紺、反應(yīng)遲鈍、活力降低等癥狀，PaO2<60 mmHg，PaO2/FiO2<300時(shí)提示建模成功［8］。對(duì)照組氣管滴入等量生理鹽水，剔除建模過程中死亡或不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，并及時(shí)補(bǔ)充備用大鼠建模，保證每組成模大鼠數(shù)量一致。模型構(gòu)建成功后開始給藥，烏司他丁各劑量組按照給藥劑量進(jìn)行腹腔注射，烏司他丁用生理鹽水稀釋后使用，模型組及對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水［9］。

1.2.2 大鼠PaO2及PaO2/FiO2檢測(cè) 給藥結(jié)束后24 h麻醉大鼠，采用血?dú)忉樃怪鲃?dòng)脈取血1 ml，血?dú)夥治鰞x測(cè)定各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2。

1.2.3 大鼠肺組織中炎癥因子水平檢測(cè) 每組取3 只大鼠，麻醉后處死并開胸獲取右側(cè)肺組織，加入組織裂解液制備肺組織勻漿，離心，收集上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明測(cè)定TNF-α、IL-6及IFN-γ水平。

1.2.4 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察及病理學(xué)損傷評(píng)分 取1.2.3 大鼠左側(cè)肺組織，生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片，得到常規(guī)病理切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理，根據(jù)HE 染色試劑盒說明進(jìn)行染色，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)大鼠肺組織損傷程度進(jìn)行評(píng)分，肺組織形態(tài)正常記為0 分；輕度肺水腫、肺泡組織中少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有少量出血記為1分；中度肺水腫、肺泡組織中較多粒細(xì)胞浸潤(rùn)、出血范圍≤25%記為2分；高度肺水腫、粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯、出血范圍≤50%記為3分；肺水腫、粒細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重、出血范圍>50%記為4分［9］。

1.2.5 大鼠肺組織肺泡液體清除率測(cè)定 每組取3 只大鼠麻醉后處死，開胸獲取大鼠全部氣管、心臟和肺臟，以伊文思藍(lán)（0.15 mg/ml）標(biāo)記的5%白蛋白等滲生理鹽水作為灌注液，經(jīng)氣管導(dǎo)管滴入右下肺，注入氧氣使灌注液充滿肺臟，機(jī)械通氣1 h 后抽取右下肺液體，酶標(biāo)儀測(cè)定液體吸光度值，并計(jì)算肺泡液體清除率（%）=（1?Ci/Cf）×100%，其中Ci 為灌注液注入前濃度，Cf為吸出后濃度［10］。

1.2.6 大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 每組取3只大鼠麻醉后處死并開胸獲取右側(cè)肺組織，采用蛋白提取試劑盒提取肺組織蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定肺組織組織蛋白濃度，將上述待測(cè)樣品加熱變性后各取20 μl 經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，TBST 洗滌后置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，加入ALX、ENaC、p-Akt、cAMP、Nedd4、Na/K-ATPase、GAPDH（1∶1 000）兔抗鼠一抗4 ℃過夜，TBST 漂洗3 次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像儀觀察并拍照，Image J 軟件分析各組大鼠肺組織中ALX、ENaC、p-Akt、cAMP、Nedd4、Na/K-ATPase蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PaO2及PaO2/FiO2分析 與對(duì)照組相比，模型組大鼠PaO2及PaO2/FiO2值均顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組PaO2及PaO2/FiO2呈升高趨勢(shì)（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表1）。

表1 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2（±s，n=9）Tab.1 PaO2 and PaO2/FiO2 of rats in each group（±s，n=9）

表1 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2（±s，n=9）Tab.1 PaO2 and PaO2/FiO2 of rats in each group（±s，n=9）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

PaO2/FiO2 461.24±14.01 230.07±11.061）296.81±12.361）2）368.29±12.951）2）3）429.93±13.071）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose PaO2/mmHg 92.13±5.01 50.06±2.341）57.37±3.721）2）68.09±4.481）2）3）81.86±5.571）2）3）4）

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整且清晰，肺泡結(jié)構(gòu)正常且分布均勻；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見大量肺充血，肺泡間隔變厚且呈塌陷狀態(tài)，肺損傷評(píng)分較高；與模型組相比，烏司他丁各劑量組肺組織損傷程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)得到一定恢復(fù)，肺損傷評(píng)分逐漸降低，其中高劑量組肺損傷程度最輕（圖1、表2）。

表2 各組大鼠肺損傷評(píng)分（±s，n=3）Tab.2 Lung injury score of rats in each group（±s，n=3）

表2 各組大鼠肺損傷評(píng)分（±s，n=3）Tab.2 Lung injury score of rats in each group（±s，n=3）

Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose Lung injury score/point 030000 100001 200012 300120 403200

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of rats in each group（×200）

2.3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達(dá)降低（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表3）。

表3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達(dá)比較（±s，n=3，pg/ml）Tab.3 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissue of rats in each group（±s，n=3，pg/ml）

表3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達(dá)比較（±s，n=3，pg/ml）Tab.3 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissue of rats in each group（±s，n=3，pg/ml）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

IFN-γ 43.17±2.17 76.94±3.231）69.55±3.141）2）60.03±3.061）2）3）51.28±2.381）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose TNF-α 51.64±4.08 138.29±9.241）117.60±8.651）2）95.42±6.911）2）3）73.19±4.311）2）3）4）IL-6 211.68±6.28 362.11±10.801）323.04±10.611）2）267.29±10.061）2）3）231.38±9.561）2）3）4）

2.4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺泡液體清除率顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組肺泡液體清除率升高（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表4）。

表4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of pulmonary alveolar fluid clearance rate of rats in each group（±s，n=3）

表4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of pulmonary alveolar fluid clearance rate of rats in each group（±s，n=3）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

Alveolar fluid clearance rate/%21.06±2.51 4.59±0.641）6.94±0.931）2）10.60±1.211）2）3）14.22±1.351）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose

2.5 各組大鼠ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組大鼠ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），Nedd4 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），Nedd4 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表5、圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織中ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway related proteins in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway in lung tissue of rats in each group（±s，n=3）

表5 各組大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway in lung tissue of rats in each group（±s，n=3）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

Na/K-ATPase/GAPDH 1.39±0.11 0.24±0.021）0.39±0.041）2）0.75±0.061）2）3）1.11±0.091）2）3）4）Groups ALX/GAPDH cAMP/GAPDH p-Akt/Akt Nedd4/GAPDH ENaC/GAPDH Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose 1.03±0.09 0.20±0.031）0.41±0.031）2）0.62±0.051）2）3）0.84±0.061）2）3）4）1.15±0.16 0.19±0.031）0.30±0.061）2）0.47±0.081）2）3）0.82±0.101）2）3）4）1.50±0.17 0.37±0.031）0.52±0.071）2）0.68±0.061）2）3）1.13±0.121）2）3）4）0.97±0.08 1.84±0.131）1.57±0.101）2）1.35±0.091）2）3）1.17±0.061）2）3）4）1.27±0.10 0.11±0.011）0.28±0.031）2）0.57±0.051）2）3）0.98±0.091）2）3）4）

3 討論

ARDS 是臨床常見呼吸類危重性疾病之一，具有呼吸窘迫、口唇發(fā)紺等臨床癥狀，以肺部炎癥、低氧血癥等為主要特征，常導(dǎo)致進(jìn)行性、急性缺氧呼吸衰竭，病死率較高，因此建立穩(wěn)定有效的動(dòng)物模型對(duì)研究ARDS發(fā)病機(jī)制及治療具有重要意義［11-12］。LPS 可顯著誘導(dǎo)肺組織病理學(xué)異常，促進(jìn)肺組織中炎癥因子表達(dá)，腹腔注射LPS 可成功構(gòu)建ARDS 模型［13］。HUANG 等［14］采用LPS 誘導(dǎo)大鼠ARDS 模型，結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，體內(nèi)TNF-α、IL-1β 等炎癥因子表達(dá)顯著升高。本研究采用暴露式氣管滴注LPS 構(gòu)建大鼠ARDS 模型，結(jié)果顯示模型組大鼠PaO2<60 mmHg、PaO2/FiO2<300，提示大鼠ARDS 模型構(gòu)建成功，HE 染色結(jié)果顯示ARDS 大鼠肺組織及肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ 等炎癥因子水平顯著升高，進(jìn)一步提示ARDS大鼠模型構(gòu)建成功。

ARDS 發(fā)病速度快，若不及時(shí)治療，炎癥細(xì)胞、液體、蛋白等會(huì)滲入肺內(nèi)，造成肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡中水腫液積累等，導(dǎo)致氧運(yùn)轉(zhuǎn)障礙、肺部功能障礙等，嚴(yán)重危害患者生命健康，盡管目前醫(yī)療水平顯著提高，但尚無治療ARDS 的有效藥物，因此開發(fā)具有抗炎及保護(hù)肺部功能的新型藥物對(duì)ARDS 臨床治療具有重要意義［15］。烏司他丁具有抑制炎癥因子釋放、緩解急性肺損傷作用，對(duì)維持肺功能具有一定積極作用［16］。張利鵬等［17］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁對(duì)膿毒癥性ARDS 大鼠具有一定治療作用，可通過抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)增加肺表面活性物質(zhì)發(fā)揮肺保護(hù)作用。多項(xiàng)研究表明烏司他丁對(duì)ARDS 及急性肺損傷療效較好，可顯著提高ARDS 患者PaO2及PaO2/FiO2并縮短ARDS康復(fù)時(shí)間［18-19］。本研究顯示，烏司他丁治療的大鼠血?dú)夥治鲋笜?biāo)（PaO2及PaO2/FiO2）顯著升高，肺組織、肺泡損傷得到一定緩解，肺組織炎癥因子水平顯著降低，肺泡液體清除率顯著升高，且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)，提示烏司他丁具有顯著緩解ARDS 大鼠肺部炎癥反應(yīng)、促進(jìn)受損肺功能恢復(fù)作用，但作用機(jī)制尚未闡明。

ENaC、Na/K-ATPase是肺部液體清除的動(dòng)力，對(duì)維持肺泡內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要意義，二者主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)Na+清除肺泡內(nèi)液體，ENaC 可將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至肺泡上皮細(xì)胞，肺泡內(nèi)積液隨著Na+進(jìn)入上皮細(xì)胞ENaC 通道，位于基底膜的Na/K-ATPase 可將Na+轉(zhuǎn)移至肺間質(zhì)，從而清除肺泡內(nèi)液體，而ENaC、Na/KATPase 表達(dá)降低可導(dǎo)致肺部組織水腫，引發(fā)肺部疾?。?0］。多項(xiàng)研究表明ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路與肺部組織中ENaC、Na/K-ATPase 表達(dá)、肺泡液體清除密切相關(guān)［21-22］。ZHANG 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑制ALX/PI3K/Nedd4 通路可下調(diào)cAMP、ENaC、Na/KATPase 表達(dá)，抑制肺泡液體清除，肺泡內(nèi)積液增多，進(jìn)而加劇急性肺損傷大鼠肺功能障礙。ALX 是介導(dǎo)細(xì)胞特異性信號(hào)的G 蛋白偶聯(lián)受體，cAMP 是將信號(hào)由細(xì)胞外轉(zhuǎn)化到細(xì)胞內(nèi)的第二信使，二者對(duì)調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)液體清除能力具有重要作用，cAMP 具有激活PI3K、引起Akt 磷酸化作用，并參與ENaC 激活與分布［23］。Nedd4 是一種泛素化蛋白，是負(fù)調(diào)控ENaC 的重要蛋白之一，Akt 磷酸化可減少Nedd4 對(duì)ENaC 的抑制作用，進(jìn)而增加Na+重吸收，張俊麗［24］研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)LX/PI3K/Nedd4 信號(hào)通路可提高大鼠體內(nèi)ENaC、Na/K-ATPase 表達(dá)及肺泡液體清除率，進(jìn)而減輕肺損傷。本研究顯示，與模型組相比，經(jīng)烏司他丁治療的大鼠肺組織ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 表達(dá)顯著升高，Nedd4 表達(dá)顯著下降，表明烏司他丁可能通過激活A(yù)LX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路發(fā)揮ARDS緩解作用。

綜上，烏司他丁可顯著緩解ARDS 大鼠肺部組織炎癥反應(yīng)及提高肺部液體清除能力，可能與激活A(yù)LX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路有關(guān)，但ARDS 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且烏司他丁作用機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H初步探究烏司他丁緩解ARDS 肺損傷的可能作用機(jī)制，未采用相關(guān)通路抑制劑或激活劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，是本研究的不足之處，仍需進(jìn)一步研究。