李培倫，劉 偉，魯萬橋，唐富江，王繼隆

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070）

魚類的免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細(xì)胞及體液相關(guān)免疫因子構(gòu)成，其中頭腎和脾臟是魚體重要的免疫器官和造血器官，也是抗體產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞生成和紅細(xì)胞發(fā)生的場(chǎng)所［1-3］。目前，國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于銀鯧（Pampus argenteus）［3］、金頭鯛（Sparus aurata）［4］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［5］、駝背鱸（Cromileptes altivelis）［6］、四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）［7］等魚類免疫器官形態(tài)組織結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道，指出不同種屬魚類物種之間其免疫器官在形態(tài)、大小及組織結(jié)構(gòu)等方面存在著明顯差異，也是長(zhǎng)期進(jìn)化過程中與其棲息生境條件相適應(yīng)的結(jié)果［6］。同時(shí)，采用解剖學(xué)、組織學(xué)等方法研究魚類免疫器官組織結(jié)構(gòu)特征是臨床診斷魚類疾病的有效方法，也可為發(fā)展水產(chǎn)品健康養(yǎng)殖提供直觀依據(jù)。

大麻哈魚（Oncorhynchus keta），屬鮭形目（Salmoniformes）鮭 科（Salmonidae）大 麻 哈 魚 屬（Oncorhynchus），俗稱大馬哈魚、太平洋鮭、秋鮭等，其分布范圍介于北緯35°—73°、東經(jīng)120°—123°，為典型的溯河生殖洄游型冷水性魚類，終生只繁殖一次，繁殖后親本死亡［8］。中國(guó)境內(nèi)大麻哈魚僅分布于黑龍江、烏蘇里江、圖們江和綏芬河水域。近年來，由于人為捕撈強(qiáng)度大、全球氣候變遷及修建各類水利工程等因素導(dǎo)致其生存空間萎縮、產(chǎn)卵場(chǎng)缺失、資源儲(chǔ)量嚴(yán)重下降［9-11］。針對(duì)上述問題，中國(guó)政府有關(guān)部門每年4—5 月在大麻哈魚的原始棲息水域積極開展人工增殖放流以恢復(fù)其種群資源，并取得顯著成效［12，13］。目前，有關(guān)大麻哈魚幼魚的研究涉及生長(zhǎng)特征［14，15］、鹽度脅迫［16，17］、耳石標(biāo)記［18］等方面，而有關(guān)其免疫器官形態(tài)組織學(xué)方面未見報(bào)道，本研究對(duì)放流前大麻哈魚幼魚的頭腎和脾臟進(jìn)行了形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，不僅能夠豐富魚類免疫器官形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)資料，還可為探索大麻哈魚放流苗種培育過程中魚體免疫應(yīng)答機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大麻哈魚幼魚來自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所湯原大麻哈魚孵化繁育基地，選取10 尾生長(zhǎng)狀況良好的個(gè)體作為試驗(yàn)樣本，其叉長(zhǎng)為（5.31±0.34）cm、體質(zhì)量為（1.52±0.37）g。

1.2 試驗(yàn)方法

使用MS-222 型麻醉劑麻醉魚體后測(cè)量其叉長(zhǎng)、體質(zhì)量，分別精確到0.01 cm 和0.01 g。解剖魚體，將完整的脾臟置于波恩試液中，后取出消化道并切掉魚體頭部、尾部及背部肌肉，將剩余部分全部置于波恩試液中固定24 h，然后剝離頭腎組織，將頭腎和脾臟分別置入75%乙醇溶液中保存。

固定的頭腎和脾臟組織經(jīng)75%～100%乙醇溶液脫水后，二甲苯透明、石蠟包埋、SLEE 切片機(jī)切片（厚度6 μm），切片經(jīng)二甲苯脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、乙醇溶液梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片保存。Carl Zeiss 光學(xué)顯微鏡觀察、SZSS2000 型顯微拍照系統(tǒng)對(duì)組織進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭腎的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)

大麻哈魚幼魚的腎臟形態(tài)為扁平長(zhǎng)條形，位于消化道背上方，緊貼體腔背側(cè)，前端膨大，可分為頭腎和體腎兩部分，其中最前端膨大為釘子狀的是頭腎，紅褐色、稍扁平。此外，頭腎在體腔內(nèi)位于心腹隔膜前的食道背面、胸腔內(nèi)咽退縮肌上方。大麻哈魚腎臟中頭腎與體腎之間無明顯的區(qū)分界限，是一個(gè)連續(xù)的整體。

大麻哈魚的頭腎外層覆蓋有一層致密結(jié)締組織形成的被膜，深褐色，內(nèi)含少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，頭腎實(shí)質(zhì)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，實(shí)質(zhì)中無明顯的小梁（圖1a）。頭腎實(shí)質(zhì)主要由淋巴細(xì)胞聚集區(qū)、粒細(xì)胞聚集區(qū)、腎小管及血竇等組成（圖1b）。淋巴細(xì)胞聚集區(qū)主要由大淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞構(gòu)成，其中小淋巴細(xì)胞體積較小、細(xì)胞質(zhì)少，較大的細(xì)胞核幾乎占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞，嗜堿性強(qiáng)被染成深藍(lán)色，與小淋巴細(xì)胞相比，大淋巴細(xì)胞的體積稍大、細(xì)胞質(zhì)稍多。粒細(xì)胞聚集區(qū)主要由中性粒細(xì)胞組成，體積較大，多為圓形或不規(guī)則的圓形，細(xì)胞核較大且偏居一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色。血竇組織明顯，由聚集成片的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及扁平細(xì)胞構(gòu)成（圖1b）。黑色素巨噬細(xì)胞無規(guī)律分散在腎實(shí)質(zhì)中，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核大，幾乎看不到細(xì)胞質(zhì)，染色呈黃褐色，大量的巨噬細(xì)胞聚集在一起形成了黑色素巨噬細(xì)胞中心，呈光亮的黃褐色斑塊兒（圖1c、圖1d）。頭腎實(shí)質(zhì)中能夠明顯看到少量腎小管及較多退化的腎小管，其中腎小管內(nèi)壁為圓形的上皮細(xì)胞，排列整齊呈圓形或橢圓形，而退化的腎小管內(nèi)上皮細(xì)胞排列疏松、腎管組織結(jié)構(gòu)模糊（圖1c）。頭腎實(shí)質(zhì)中靜脈血管管腔較大，內(nèi)含大量成熟和不成熟的紅細(xì)胞，且在靜脈血管壁周邊看到了由排列緊密的腎上腺細(xì)胞聚集形成的小團(tuán)狀的腎上組織結(jié)構(gòu)，腎上腺細(xì)胞胞體大而胞核小，且染色較淺（圖1d）。

2.2 脾臟的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)

大麻哈魚幼魚的脾臟較小，為扁平不規(guī)則的橢圓狀，位于胃組織的下方，腸道中部背面，顏色呈暗紅色，表面光滑，背面稍凸，腹面平滑。大麻哈魚幼魚脾臟外具有一層較薄的被膜，主要由薄層結(jié)締組織和一層扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成（圖2a）。被膜以下為脾臟的實(shí)質(zhì)部分，未見明顯的脾小葉和脾小梁，但血管豐富，中央靜脈及動(dòng)脈血管可貫穿整個(gè)脾臟，其中靜脈血管的管腔較大，但管壁薄，而動(dòng)脈多附著于中央靜脈血管邊上，管腔較小，但管壁較厚，主要由平滑肌和扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成（圖2b）。脾臟實(shí)質(zhì)主要由分界不明顯的紅髓和白髓交替分布形成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中紅髓區(qū)域所占面積較大，內(nèi)含大量紅細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而白髓所占面積較小，內(nèi)含大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，其中小淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞居多（圖2a、圖2c）。黑色素巨噬細(xì)胞較多，黃褐色，在脾臟實(shí)質(zhì)中分布無明顯規(guī)律，靜脈、血竇、紅髓等結(jié)構(gòu)中均有（圖2c、圖2d）。脾實(shí)質(zhì)中血竇較多，血竇主要由血細(xì)胞成片聚集而成，其形狀、大小不一，相鄰兩個(gè)血竇之間為網(wǎng)狀纖維組成的脾竇，無固定形態(tài)，而脾索分布于脾竇的周圍，呈長(zhǎng)短不一的條索狀，由淋巴細(xì)胞、長(zhǎng)桿形的內(nèi)皮細(xì)胞及結(jié)締組織組成（圖2d）。

圖2 放流前大麻哈魚幼魚脾臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

3 小結(jié)與討論

3.1 頭腎的組織特點(diǎn)和功能

魚類的腎臟可分為頭腎和體腎兩部分，其中絕大部分魚類的頭腎在魚體生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)逐漸失去泌尿排泄功能，但卻保持了發(fā)達(dá)的免疫功能和造血功能，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［2］出膜后26～43 d 頭腎中腎小管逐漸萎縮消失；2 月齡斑馬魚（Danio rerio）［19］頭腎實(shí)質(zhì)中的腎單位開始退化，1 齡時(shí)退化完全；草魚（Ctenopharyngodon idella）［20］頭腎在孵化后2 d 出現(xiàn)腎小管，6 d 出現(xiàn)造血干細(xì)胞及淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞，85 d 腎小管完全消失，而成年彈涂魚（Periophthalmus koelreuteri）［21］等少數(shù)魚類的頭腎中仍保留腎單位，無退化消失現(xiàn)象。大多數(shù)魚類的頭腎可分為3 個(gè)功能期，分別為單純的泌尿功能期、泌尿與免疫混合功能期及單純的免疫功能期［22］，而本研究中放流前大麻哈魚的頭腎實(shí)質(zhì)中能看到腎小管及退化的腎小管，表明該時(shí)期大麻哈魚幼魚的頭腎處于泌尿與免疫混合功能期。魚類的頭腎在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有所差別，大麻哈魚的頭腎與體腎之間無明顯區(qū)分界限，是一個(gè)連續(xù)的整體，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與池沼公魚（Hypomesus olidus）、花鱸（Lateolabrax japonicus）等［23］魚類相同，與銀鯧［3］、駝背鱸［6］、鯔（Mugil cephalus）［24］等魚類的頭腎和體腎被心腹隔膜分隔開不同。

大麻哈魚頭腎外周具有一層被膜，與駝背鱸［6］、鯔［24］等魚類相似，不同于斜帶石斑魚［5］、花鱸［23］等魚類的頭腎外周僅有一層較薄的膠原纖維包裹。大麻哈魚幼魚頭腎實(shí)質(zhì)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無明顯小梁，含有淋巴細(xì)胞聚集區(qū)、粒細(xì)胞聚集區(qū)及血竇等，與駝背鱸［6］、四指馬鲅［7］等魚類的頭腎結(jié)構(gòu)相似。免疫細(xì)胞是機(jī)體參與免疫反應(yīng)或與應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，分為參與特異性免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞和參與非特異性免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等［25］。胡玲玲等［26］研究指出巨噬細(xì)胞內(nèi)含有棕黃色顆粒和少量淋巴細(xì)胞，不僅能夠參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，又具有貯存血黃素、吞噬可溶性顆粒物質(zhì)的功能。本研究中大麻哈魚幼魚肝臟實(shí)質(zhì)中含有大、小淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、棕褐色的黑色素巨噬細(xì)胞、堆積成塊兒的黑色素巨噬細(xì)胞中心等功能較為齊全的各類免疫細(xì)胞，說明該時(shí)期的頭腎在大麻哈魚幼魚參與免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮一定功能。此外，大麻哈魚幼魚頭腎實(shí)質(zhì)中含有大量靜脈血管和血竇，內(nèi)含成熟及未成熟的紅細(xì)胞，表明頭腎具有較強(qiáng)的造血功能。

3.2 脾臟的組織特點(diǎn)和功能

脾臟雖是魚類胚胎發(fā)育過程中發(fā)育最晚的免疫器官，但其卻是魚體紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生、儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所［3］。硬骨魚類與軟骨魚類的脾臟結(jié)構(gòu)差異較大，其中軟骨魚類的脾臟較大，造血功能強(qiáng)，實(shí)質(zhì)分為界限清晰的紅髓和白髓，而硬骨魚類脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)的紅髓和白髓是混合排列的且界限模糊，兼具免疫和造血功能［26］。大麻哈魚幼魚同大部分魚類一樣，肝實(shí)質(zhì)中紅髓與白髓混合排列，無明顯界限，如銀鯧［3］、鯔［24］等，不同于黃鱔（Monopterus albus）［27］等魚類脾臟實(shí)質(zhì)具有界限清晰的白髓。此外，大多數(shù)魚類的脾臟外層都有一層薄的被膜，與脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成脾臟支架，被膜結(jié)締組織向?qū)嵸|(zhì)內(nèi)延伸形成脾小梁，但由于結(jié)締組織中肌纖維不發(fā)達(dá)，故脾小梁結(jié)構(gòu)不明顯或沒有。本研究中放流前大麻哈魚幼魚脾臟外具有一層較薄的被膜，無明顯的脾小梁結(jié)構(gòu)，與銀鯧［3］、駝背鱸［6］、鯔［24］等魚類相似，而與四指馬鲅［7］等少數(shù)具有明顯脾小梁結(jié)構(gòu)的魚類不同。

大麻哈魚幼魚脾臟內(nèi)中央靜脈及其周圍的動(dòng)脈發(fā)達(dá)，與此同時(shí)脾臟實(shí)質(zhì)中血竇較多，均含有大量成熟和未成熟的紅細(xì)胞，符合造血發(fā)育的特點(diǎn)，證實(shí)脾臟具有較強(qiáng)的造血及儲(chǔ)血功能。研究表明，脾臟主要通過脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能，如草魚［28］在擁擠脅迫條件下脾臟內(nèi)的白細(xì)胞比容降低，許氏平鮋（Sebastes schlegeli）［29］受鹽度脅迫后脾臟中的粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，推斷放流前大麻哈魚幼魚脾臟中大量的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和黑色素巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。此外，大麻哈魚幼魚脾臟實(shí)質(zhì)中黑色素巨噬細(xì)胞較多，靜脈、血竇、紅髓等結(jié)構(gòu)中均有分布，部分巨噬細(xì)胞聚集成群形成黑色素巨噬細(xì)胞中心，可為血細(xì)胞的更新代謝提供有力保障，與駝背鱸［6］、鯔［24］、條石鯛［26］等魚類相似，但與紅笛鯛［25］、巖原鯉（Procypris rabaudi）［30］等魚類脾臟中無明顯的黑色素巨噬細(xì)胞中心不同，進(jìn)一步證明了魚類脾臟的組織結(jié)構(gòu)存在種間差異。