喬香君，吳 影，趙麗娜，古紹彬

（1. 鄭州航空港經(jīng)濟(jì)綜合實驗區(qū)綜保區(qū)和口岸服務(wù)局，河南鄭州 450019；2. 河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） 屬于一種對人畜無毒害的G+細(xì)菌，產(chǎn)芽孢[1-2]。其芽孢可在胃腸道中生存和發(fā)芽[3]，并代謝分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶[4]，增強(qiáng)腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和吸收能力[5]。同時，還具有較強(qiáng)的抗逆能力和廣譜抗菌活性[2，6]，穩(wěn)定性好，能調(diào)節(jié)動物免疫力，可作為抗生素生長促進(jìn)劑的替代品[7-10]，在動物生產(chǎn)中越來越受到重視。Gu W 等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，將解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238 喂食尼羅羅非魚（Oeochromis niloticus）可以提高生長性能，并提高對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗病能力。Lei X 等人[12]證明解淀粉芽孢桿菌可提高肉雞生產(chǎn)性能，減輕免疫應(yīng)激，并且改善腸道菌群介導(dǎo)的病原體抗性。Wang Y 等人[13]發(fā)現(xiàn)B. amyloliquefaciensSC06 可調(diào)節(jié)宿主代謝和腸道菌群，保護(hù)小鼠免受高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和肝損傷。此外，研究發(fā)現(xiàn)淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238 可通過提高產(chǎn)蛋雞的免疫力，和調(diào)節(jié)其生殖激素來有效提高產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)[14]。

另外，解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種胞外酶，能夠促進(jìn)大分子營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高腸道吸收力和營養(yǎng)消化率[15-16]。加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)解淀粉芽孢桿菌作為淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶和半纖維素酶等食品酶的來源，被越來越多地應(yīng)用到食品加工中[15，17]。因此，近些年解淀粉芽孢桿菌也成為應(yīng)用廣泛的益生菌之一[18-20]。目前，國內(nèi)外學(xué)者多采用固體發(fā)酵法獲得生產(chǎn)中使用的解淀粉芽孢桿菌[21]，但這種方法制備的是菌體與發(fā)酵基質(zhì)的混合物，很難分離得到解淀粉芽孢桿菌，不利于用解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)食品酶。

為了進(jìn)一步提高解淀粉芽孢桿菌BA118 菌株液體發(fā)酵水平，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計試驗，對BA118 的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了該解淀粉芽孢桿菌BA118 高密度培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，為其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌BA118，保藏于河南科技大學(xué)微生物實驗室。

1.2 儀器和試劑

WFZ·UV-2800AH 型紫外- 可見分光光度計，尤尼柯產(chǎn)品；PHS-25 型pH 計，雷磁產(chǎn)品。

玉米淀粉、土豆淀粉、玉米漿、黃豆餅粉，市售；糊精，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 培養(yǎng)基

（1） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0~7.2，固體需加2%的瓊脂。

（2） 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）?？扇苄缘矸?0.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液的制備

將解淀粉芽孢桿菌的保藏菌種接種到牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，備用。取2 環(huán)活化菌種，接入裝有50 mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成種子液。

1.4.2 解淀粉芽孢桿菌BA118 培養(yǎng)方法

將種子液接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種量5%，裝液量30/250 mL，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.3 菌體計數(shù)方法

（1） 平板計數(shù)。參照文獻(xiàn)[22]。

（2） 比濁法。參照文獻(xiàn)[23]。

1.4.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

通過單因素試驗分別考查發(fā)酵時間、初始pH值、發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速和裝液量對解淀粉芽孢桿菌BA118 發(fā)酵菌體密度的影響。

1.4.5 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

（1） 碳源。選擇蔗糖、麥芽糖、糊精、玉米淀粉、土豆淀粉為替代碳源。

（2） 氮源。分別以牛肉膏、玉米漿、黃豆餅粉、胰蛋白胨+尿素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)比1∶1）、胰蛋白胨+酵母膏+尿素（2∶2∶1） 替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的大豆蛋白胨制成培養(yǎng)基。

（3） 無機(jī)鹽。分別以MgSO4、CaCO3、MnSO4、KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 為替代無機(jī)鹽。

1.4.6 響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取糊精、玉米漿、MgSO4和KH2PO4+K2HPO4為自變量，運(yùn)用Design Expert 8.0.5 設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗。以菌體密度為響應(yīng)值，采用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。對響應(yīng)曲面分析得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3 次平行發(fā)酵試驗，取平均值，驗證模型結(jié)果是否可靠，得出最終優(yōu)化結(jié)果。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 作圖，用SPSS 22.1 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。所有數(shù)值在p＜0.05 時均被認(rèn)為是顯著的，并以平均值±s.e 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA118 生長特性研究

每2 h 取發(fā)酵樣品測定OD600nm 光密度值，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)，繪制解淀粉芽孢桿菌BA118 的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線。

BA118 發(fā)酵條件的優(yōu)化見圖1。

由圖1（a） 可知，BA118 在0~4 h 處于生長延滯期；4~26 h 為該菌的對數(shù)生長期；26~32 h 時達(dá)到平臺期；在32 h 后，菌體進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)呈下降趨勢。因此，選擇BA118 的最佳發(fā)酵時間為28 h。

圖1 BA118 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 pH 值對BA118 生長的影響

微生物都有其最適生長pH 值，B. amyloliquefaciens的最適生長pH 值在7.5 上下，菌株之間的最適pH 值存在一定差異[24]。將種子液分別接種于pH 值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28 h后平板計數(shù)得出不同pH 值對菌體發(fā)酵水平影響的折線圖。

由圖1（b） 可知，初始pH 值為6.0~8.0 時，發(fā)酵菌體數(shù)量達(dá)到2.34×108~2.48×108CFU/mL，在pH 值7.5 時，BA118 菌體數(shù)量達(dá)到最大值，可見初始pH 值對菌體數(shù)量影響不大。車曉曦等人[25]研究了解淀粉芽孢桿菌SAB-1 發(fā)酵條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)初始pH 值在5.0~8.0 的條件下，發(fā)酵產(chǎn)量差別不大，與試驗結(jié)果一致。但SAB-1 在pH 值6.0 時菌體數(shù)量達(dá)到最高峰，在pH 值7.0 時產(chǎn)量最低，與試驗中BA118 的最適pH 值7.5 不同，反映出不同的解淀粉芽孢桿菌菌株的最適生長pH 值有差異的特點(diǎn)。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對BA118 生長的影響

將種子液接種于最適pH 值的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度分別為25，30，35，40，45 ℃下培養(yǎng)48 h，然后平板計數(shù)。由圖1（c） 可知，發(fā)酵溫度為20~30 ℃時，菌體的生長代謝隨著溫度的升高而加快；30 ℃為BA118 最適生長溫度，菌體數(shù)量達(dá)到2.7×108CFU/mL。

2.2.3 溶氧量對BA118 生長的影響

發(fā)酵液的溶氧濃度直接影響微生物的酶的活性、代謝途徑及產(chǎn)物產(chǎn)量[26-27]。發(fā)酵液的溶氧量的主要受裝液量和轉(zhuǎn)速影響。在其他發(fā)酵條件相同的前提下，分別以150，170，190，210，230 r/min 的轉(zhuǎn)速對解淀粉芽孢桿BA118 進(jìn)行發(fā)酵，獲得不同轉(zhuǎn)速對BA118發(fā)酵水平影響的折線。由圖1（d） 可知，隨著轉(zhuǎn)速的不斷增加，菌體數(shù)量呈上升趨勢，并在230 r/min時取得最大值。解淀粉芽孢桿菌BA118 為好氧菌，故轉(zhuǎn)速越高，通氣量越大，菌株生長越旺盛。將種子液分別接種到裝液量為20/250，30/250，40/250，50/250 mL 的最適pH 值的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，平板計數(shù)。由圖1（e） 可知，菌體數(shù)量隨裝液量的增加呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，并在40/250 mL 時取得最大值。當(dāng)裝液量少于40/250 mL時，發(fā)酵液中的碳氮源等營養(yǎng)成分較少，菌體生長受到限制；當(dāng)裝液量大于40/250 mL 時，溶氧含量降低，影響微生物的有氧呼吸，導(dǎo)致活菌數(shù)量下降。因此，選擇BA118 的裝液量為40/250 mL，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為230 r/min。

2.2.4 接種量對BA118 生長的影響

接種量對菌體生長影響較大，合適的接種量能提高微生物對培養(yǎng)基的利用率，加速菌株的生長[28]；分別以1%，2%，3%，4%，5%的接種量進(jìn)行發(fā)酵，平板計數(shù)。由圖1（f） 可知，BA118 的最適接種量為2%，過大的接種量會大大消耗發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分，并代謝產(chǎn)生過多的次級代謝產(chǎn)物而影響菌體的生長[29]。

通過單因素試驗確定，在pH 值7.5，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速230 r/min，接種量2%，裝液量40/250 mL 條件下進(jìn)行發(fā)酵時，菌體數(shù)量達(dá)到最高，為3.73×108CFU/mL。

2.3 BA118 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳源、氮源和無機(jī)鹽對菌體數(shù)量的影響

BA118 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化見圖2。

由圖2 可知，當(dāng)碳源為5 g/L 糊精時，菌體數(shù)量明顯高于其他碳源。氮源為牛肉膏和玉米漿時，對BA118 的發(fā)酵水平影響較大。玉米漿營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、可溶性蛋白、生物素、維生素、金屬離子和糖等，能夠替代酵母粉、牛肉膏，降低生產(chǎn)成本[30]。因此，確定10 g/L 玉米漿為BA118 生長所需最佳氮源。在無機(jī)鹽試驗中發(fā)現(xiàn)，添加3 g/L MgSO4和7 g/L KH2PO4+K2HPO4兩類無機(jī)鹽時，均獲得了較高生物量，確定MgSO4和KH2PO4+K2HPO4同時為BA118 生長所需無機(jī)鹽。通過單因素試驗篩選出BA118 的最適培養(yǎng)基為糊精5 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO43 g/L和KH2PO4+K2HPO47 g/L。

圖2 BA118 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

但上述單因素試驗無法分析各營養(yǎng)因素之間的交互作用，響應(yīng)面法通過回歸方程擬合建立各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析優(yōu)化各因素的工藝參數(shù)，并可預(yù)測響應(yīng)值[31]，是一種能高效降低試驗次數(shù)且準(zhǔn)確的分析模型。

2.3.2 Box- behnken 響應(yīng)面試驗

（1） 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計與結(jié)果。由單因素試驗選取糊精、玉米漿、MgSO4和KH2PO4+K2HPO44 個因素為自變量，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析。

響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計見表1，Box-behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計/g·L-1

表2 Box-behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.0.5 軟件對上述表2 中各試驗點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，用于研究顯著因素糊精添加量（A），玉米漿添加量（B），MgSO4添加量（C） 和KH2PO4+ K2HPO4添加量（D） 之間的相互作用，并確定其最佳水平。得到菌體數(shù)量（Y） 對自變量的二次多項回歸模型方程：

回歸方程的方差分析見表3。

由表3 可知，該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.929 5，表明僅有7.05%的變異不能由此模型解釋；因變量菌體數(shù)量與本研究所考查自變量之間的回歸模型極顯著（p＜0.01），表明數(shù)據(jù)與模型擬合良好、模型成立，擬合程度較高；失擬項p值為0.098 3，表明失擬項不顯著，說明試驗所得的二次方程能較好的對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測，即能較好地預(yù)測菌體數(shù)量隨MgSO4、玉米漿、糊精、KH2PO4+K2HPO4的變化規(guī)律。從回歸方程可知，B，A2，B2，C2，D2極顯著（p＜0.01），A，C，AD，BC，BD顯著（p＜0.05），其他影響均不顯著（p＞0.05）。各自變量對菌體數(shù)量影響的主次因素依次為玉米漿＞硫酸鎂＞糊精＞KH2PO4+K2HPO4。

表3 回歸方程的方差分析

（2） 響應(yīng)面交互作用分析。根據(jù)上述擬合回歸方程，通過軟件分析得到交互因子的響應(yīng)面圖和等高線圖。發(fā)現(xiàn)3 個響應(yīng)表面圖都具有一個帶有向下開口的凸表面。每個響應(yīng)曲面代表著，2 個因素保持在編碼水平的0 水平，另外2 個獨(dú)立因素之間的交互作用。通過響應(yīng)面圖曲面的坡度變化和等高線圖的形狀，可以判斷出優(yōu)化因子之間交互作用的強(qiáng)弱。若響應(yīng)面圖曲面坡度比較陡峭，說明該因素對響應(yīng)值比較敏感；相反，若響應(yīng)面圖曲面比較平緩，說明該因素對響應(yīng)值不敏感。從等高線圖的形狀分析，如果為圓形，說明因素間交互作用弱；如果為橢圓形，代表因素間交互作用較強(qiáng)[32-33]。

AD交互作用對BA118 菌體數(shù)量的影響見圖3，BC交互作用對BA118 菌體數(shù)量的影響見圖4，BD交互作用對BA118 菌體數(shù)量的影響見圖5。

圖4 BC 交互作用對BA118 菌體密度的影響

由圖3 ~圖5 可知，發(fā)酵液BA118 菌體數(shù)量隨著糊精、玉米漿、硫酸鎂和KH2PO4+K2HPO4添加量的變化，均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，曲面的頂點(diǎn)即為菌體數(shù)量最大值點(diǎn)。其中，糊精和KH2PO4+K2HPO4的交互作用，玉米漿和硫酸鎂的交互作用，以及玉米漿和KH2PO4+K2HPO4的交互作用的響應(yīng)面曲面的坡度陡峭，等高線圖呈橢圓形，表明兩因子交互作用較強(qiáng)。

圖3 AD 交互作用對BA118 菌體數(shù)量的影響

圖5 BD 交互作用對BA118 菌體數(shù)量的影響

（3） 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗證。結(jié)合響應(yīng)值與各因素關(guān)系的二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ图叭S響應(yīng)面圖，確定發(fā)酵液的最優(yōu)配方各組分質(zhì)量濃度為玉米漿11.36 g/L，糊精5.50 g/L，MgSO43.38 g/L，KH2PO4+K2HPO45.96 g/L。在優(yōu)化配方條件下，獲得的解淀粉芽孢桿菌BA118菌體數(shù)量的理論預(yù)測值為6.345 51×109CFU/mL。結(jié)合試驗實際操作，將培養(yǎng)基各組分質(zhì)量濃度調(diào)整為糊精5.50 g/L，玉米漿11.50 g/L，MgSO43.50 g/L，KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 6.00 g/L。為驗證預(yù)測結(jié)果，在該配方下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗（重復(fù)3 次），結(jié)果發(fā)酵獲得的菌體數(shù)量分別為6.33×109，6.61×109，6.98×109CFU/mL，均值為6.64×109CFU/mL，與響應(yīng)面理論預(yù)測值6.345 51×109CFU/mL 基本吻合，證實了響應(yīng)面模型的有效性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗與響應(yīng)面設(shè)計分析，確定了解淀粉芽孢桿菌BA118 的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間28 h，初始pH 值7.5，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速230 r/min，接種量2%，裝液量40/250 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方各組分質(zhì)量濃度為糊精5.50 g/L，玉米漿11.50 g/L，硫酸鎂3.50 g/L，磷酸氫二鉀+磷酸二氫鉀6.00 g/L。通過發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的工藝優(yōu)化，最終將菌體產(chǎn)量提高了28.3 倍，菌體數(shù)量達(dá)到6.64×109CFU/mL，為解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。