姚 佳，陳開(kāi)琴，余 鳳

（1. 黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻 558000；2. 遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州遵義 563006）

0 引言

云霧貢茶屬于綠茶，產(chǎn)于貴州黔南州省貴定縣境內(nèi)，是都勻毛尖茶的主產(chǎn)地，以茶鮮葉為原料加工而制成，色澤嫩綠透黃，外形細(xì)緊彎曲，滿(mǎn)披白毫，在元代已成為朝廷貢茶，清朝被列為國(guó)內(nèi)八大名茶之一。因云霧山位于烏、沅、盤(pán)三江之分水嶺，且山高且連綿、多峭壁、云霧彌漫，因其特殊的地形，茶葉品質(zhì)佳。茶多糖（Tea polysaccharides，TPS）是茶葉中一種由糖類(lèi)和蛋白質(zhì)組成具有生理活性的多糖，具有多種保健功能，可治療糖尿病、腎病、癌癥等疾病[1-3]。近年來(lái)，為了提高茶葉的附加利用值，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)茶葉中功能成分的開(kāi)發(fā)和利用，綠茶中的茶多酚和咖啡堿是集中開(kāi)發(fā)比較多的成分，關(guān)于綠茶多糖的研究開(kāi)發(fā)比較少，隨著綠茶保健功能不斷被揭示，綠茶多糖也受到學(xué)者們的關(guān)注，綠茶中的多糖根據(jù)茶葉品種，產(chǎn)地、采摘季節(jié)不同，茶葉中多糖含量各有不同。近年來(lái)，研究人員對(duì)綠茶中的多糖提取常用溶劑提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法等。為提高云霧貢茶的利用率，采用云霧貢茶中夏秋茶為研究對(duì)象，進(jìn)行茶多糖的提取，以期為提高云霧貢茶的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云霧貢茶，購(gòu)自貴定縣云霧茶廠。

CJ-G040 型超聲波提取器，深圳市超潔科技實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；FCR2002-UF-P 型超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司產(chǎn)品；GXZ-9140MBE 型鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；HH-S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；CP214 型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品制備方法

稱(chēng)取1 g 云霧貢茶粉末于50 mL 錐形瓶中，以水作為提取溶劑，設(shè)置相應(yīng)的超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間，提取完成后，過(guò)濾得粗多糖提取液。往茶葉提取液中加入0.5 g 活性炭，攪拌均勻，40 ℃下恒溫水浴加熱15 min，進(jìn)行脫色處理。Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇= 4∶1，mL∶mL） 與多糖溶液混合，用磁力攪拌器振蕩35 min，再以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min 進(jìn)行脫蛋白處理，收集上清液，即為脫蛋白的茶多糖提取液。

1.3 茶多糖提取率的計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]，采用硫酸- 蒽酮法。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=4.381 9C-0.005 2，R2=0.994 8，葡萄糖質(zhì)量濃度范圍為0~0.02 mg/mL。吸取1 mL 脫蛋白茶多糖提取液，稀釋后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定多糖得率，根據(jù)回歸方程和公式（1） 計(jì)算茶多糖提取率：

式中：Y——多糖提取率，%；

C——茶多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

V——供試液體積，mL；

m——甜茶質(zhì)量，mg。

1.4 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[6-8]，并結(jié)合爬坡試驗(yàn)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，固定超聲功率100 W，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度60 ℃，考查料液比（1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，g∶mL） 對(duì)茶多糖提取率的影響；固定料液比1∶80（g∶mL），超聲時(shí)間60 min，超聲溫度60 ℃時(shí)，考查超聲功率（50，100，150，200，250 W） 對(duì)茶多糖得率的影響；在料液比1∶80（g∶mL），超聲功率150W，超聲時(shí)間60 min 時(shí)，考查超聲溫度（40，50，60，70，80 ℃） 對(duì)茶多糖提取率的影響；在料液比1∶80（g∶mL），超聲功率150 W，超聲溫度70 ℃時(shí)，考查超聲時(shí)間（30，60，90，120，150 min） 對(duì)茶多糖提取率的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3 次，結(jié)果以X±S表示，單因素試驗(yàn)采用Origin 2018 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和圖形處理，用Design Expert 11.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)茶多糖提取率的影響

超聲功率對(duì)茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖1 可知，當(dāng)超聲功率為50~150 W 時(shí)，茶多糖提取率呈上升趨勢(shì)，在150 W 時(shí)達(dá)到8.21%±0.38%，此后超聲功率增大，超聲波的空化效應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)，茶葉提取率基本保持不變，所以選擇超聲功率150 W 為最佳提取功率。

2.1.2 超聲溫度對(duì)茶多糖提取率的影響

溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，所以多糖溶出的量會(huì)隨著溫度升高而增加，但因?yàn)槎嗵堑慕Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，羥基多，在高溫下不穩(wěn)定，溫度過(guò)高，多糖容易降解。

超聲溫度對(duì)茶多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著超聲溫度的增加，多糖得率50~70 ℃上升幅度比較大，超過(guò)70 ℃后，增加比較少，所以選擇70 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響

隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，在一定的溶劑濃度下，物質(zhì)會(huì)達(dá)到飽和，就不會(huì)再溶出有效物質(zhì)，多糖從茶葉中溶解出來(lái)的量會(huì)維持在一個(gè)水平不再增加。

超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖3 可知，30~60 min 時(shí)溶出茶多糖的溶出率增加，90 min 以后不再變化。因此，選擇90 min 為最佳超聲時(shí)間。

2.1.4 料液比對(duì)茶多糖提取率的影響

料液比對(duì)茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)茶多糖提取率的影響

隨著料液比的增加，多糖提取率增加，當(dāng)料液比在1∶80 后，多糖溶出基本保持不變。一般來(lái)說(shuō)，溶劑過(guò)少，溶出的有效物質(zhì)在低濃度下溶出量有限，如果增加溶劑，有效物質(zhì)的溶出也跟著增加，當(dāng)提取溶劑達(dá)到一定量時(shí)，需要的目標(biāo)物質(zhì)已經(jīng)大部分溶出，一些雜質(zhì)也開(kāi)始溶出，使得需要的目標(biāo)物質(zhì)含量不再增加，考慮到操作和節(jié)約成本，所用的溶劑越少越好。因此，選擇1∶80 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 11.0 軟件，選擇超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）、料液比（D） 4 個(gè)因素為響應(yīng)變量，茶多糖提取率（Y） 為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-behnken。

BBD 試驗(yàn)因素及編碼水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 BBD 試驗(yàn)因素及編碼水平設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表1 中的試驗(yàn)因素和編碼水平，Design Expert 11.0 中Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)產(chǎn)生了29 個(gè)試驗(yàn)條件，其中有5 個(gè)是中心組合試驗(yàn)，按表2 中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算得到茶多糖提取率，依次填入表中，并對(duì)表數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸分析。

Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)表2 進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

回歸模型的p＜0.000 1，回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)的p=0.176＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.968 9，R2Adj=0.937 8 說(shuō)明模型的擬合程度良好，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用來(lái)預(yù)測(cè)和分析云霧貢茶多糖的提取工藝。模型中A，B，C，D的p值均小于0.001，說(shuō)明各因素對(duì)茶多糖得率的影響極顯著。

回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 各因素間交互作用分析

采用Design Expert 11.0 軟件，針對(duì)表1 和2 中的結(jié)果做響應(yīng)面圖，響應(yīng)面坡度的陡峭程度表明隨著因素的變化，其對(duì)應(yīng)響應(yīng)值的變化情況，如果坡度相對(duì)平緩，表明響應(yīng)值可以忍受條件的變化；如果坡度較陡，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的變化非常敏感。

各因素相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，隨著超聲功率與超聲溫度、超聲功率與超聲時(shí)間、超聲功率與料液比、超聲溫度與料液比、超聲時(shí)間與料液比坡度均比較陡峭，說(shuō)明這些條件的變化對(duì)茶多糖的提取影響比較大，隨著個(gè)因素的變化，均出現(xiàn)了茶多糖先增加后降低的情況，說(shuō)明工藝優(yōu)化找到了最佳的提取點(diǎn)，工藝優(yōu)化成功，試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢院芎玫仡A(yù)測(cè)茶多糖的提取。

圖5 各因素相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

采用Design Expert 11.0 軟件做相應(yīng)的等高線圖，而等高線主要是反映因素間的交互作用情況，橢圓形表示因素間的交互作用明顯，圓形則表示交互作用不顯著。

各因素相互作用對(duì)多糖提取率影響的等高線圖見(jiàn)圖6。

由圖6 可知，超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時(shí)間之間呈明顯的橢圓形，說(shuō)明兩因素之間交互作用明顯，而超聲功率與超聲時(shí)間、超聲功率與料液比、超聲溫度與料液比、料液比與超聲時(shí)間之間的等高線呈圓形，交互作用不明顯。

圖6 各因素相互作用對(duì)多糖提取率影響的等高線圖

2.2.3 云霧貢茶中茶多糖提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)預(yù)測(cè)分析，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果可得多糖的最佳工藝條件為超聲功率182.011 W，超聲溫度69.412 ℃，超聲時(shí)間99.929 min，料液比1 ∶117.786（g∶mL），茶多糖提取率預(yù)測(cè)為9.617%，為簡(jiǎn)便試驗(yàn)操作，選擇為超聲功率180 W，超聲溫度69 ℃，超聲時(shí)間100 min，料液比1∶118（g∶mL）進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，云霧貢茶中茶多糖提取率為9.21%±0.25%，與預(yù)測(cè)值結(jié)果接近，說(shuō)明該方法得到的優(yōu)化條件可行。

3 結(jié)論

對(duì)綠茶多糖進(jìn)行研究是實(shí)現(xiàn)茶葉深加工的方法之一，可以提高茶農(nóng)收益，減少夏秋茶的浪費(fèi)。多糖的提取一般采用水提醇沉法，因?yàn)槌暡ň哂锌栈?yīng)，具有縮短提取多糖的時(shí)間，增加多糖提取效率的作用[10]。所以，采用超聲波提取茶多糖，方差分析中顯示，超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比的p值均小于0.001，說(shuō)4 個(gè)因素對(duì)茶多糖的提取影響均顯著；超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時(shí)間之間的p值均小于0.05，等高線圖中均為明顯的橢圓形。所以，超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時(shí)間之間還存在一定的交互作用，當(dāng)超聲功率180 W，超聲溫度69 ℃，超聲時(shí)間100 min，料液比1∶118（g∶mL） 時(shí)，云霧貢茶中茶多糖的提取率為9.21%±0.25%。該工藝穩(wěn)定可行，可以作為云霧貢茶中茶多糖的提取工藝。