劉嘯宇，后夢情，程安琪，胡傳俊，姚 坤，吳 蕭

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234200）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前轉(zhuǎn)化雙子葉植物最為廣泛使用的方法之一，該方法簡單，轉(zhuǎn)化機(jī)制明確、周期短，同時因轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)少，因此大大地降低了因同源抑制而產(chǎn)生基因沉默的可能性[1]。同時，該技術(shù)具有轉(zhuǎn)育周期較短、遺傳性狀較為穩(wěn)定、變異幅度較小、對農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀干擾較少等特點(diǎn)，已成為我國農(nóng)作物進(jìn)行外源基因?qū)霑r最常用的技術(shù)手段[2-3]。但同時也面臨一些重要的技術(shù)問題，如轉(zhuǎn)化效率低和轉(zhuǎn)化結(jié)果的未知性和不可控性等。為了進(jìn)一步了解根癌農(nóng)桿菌T-DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，探討是否可以通過提高T- 復(fù)合物招募蛋白VBP 在農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量來提高T-DNA 的轉(zhuǎn)化效率，這在植物轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 所用菌株

Agrobacterium tumefaciensC58，E.coliDH5α，實(shí)驗(yàn)室保存，菌液與70%的甘油等體積保存在凍存管中，凍存于-75 ℃冰箱中。

1.1.2 所用質(zhì)粒

Prset-a，具有T7 啟動子，實(shí)驗(yàn)室保存；pegfp-n1，含有egfp基因的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室保存；prset-agfp1，Atu4856 基因上游495 bp 序列，帶上標(biāo)記基因gfp，插入啟動子已除去的prset-a 質(zhì)粒，構(gòu)建。

1.1.3 所用引物

所使用的引物信息（劃線部分為酶切位點(diǎn)） 見表1。

表1 所使用的引物信息（劃線部分為酶切位點(diǎn)）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增帶有標(biāo)記基因的Atu4856啟動子序列

（1） 擴(kuò)增495 bp 的啟動子序列。以Pv1、Pv2 為引物，BamHⅠ酶切位點(diǎn)在引物Pv1 上，配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)，結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收產(chǎn)物[4-5]。

（2） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增標(biāo)記基因——gfp。以Pgfp2，Pg2 為引物，以質(zhì)粒pegfp-n1 為模板，BamHⅠ酶切位點(diǎn)在引物Pg2 上，待反應(yīng)結(jié)束后，回收PCR產(chǎn)物，步驟同1.2.1 步驟（1）。

（3） 擴(kuò)增Atu4856 啟動子帶標(biāo)記基因的全長序列。將1.2.1 中（1） （2） 步驟的產(chǎn)物混合，以Pv1 和Pg2 為引物，配置反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增[6-7]，產(chǎn)物回收，步驟同1.2.1 步驟（1）。

重疊延伸PCR 的過程和體系見圖1，PCR 反應(yīng)的體系見表2。

圖1 重疊延伸PCR 的過程和體系

表2 PCR 反應(yīng)的體系/μL

1.2.2 提取大腸桿菌prset- a 質(zhì)粒

構(gòu)建啟動子探針載體的基本質(zhì)粒prset-a 見圖2。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增得到不含T7 啟動子的prset- a 質(zhì)粒

在T7 啟動子基因序列的兩端設(shè)計(jì)引物P1 和P2，均含有BamHⅠ限制性位點(diǎn)。同時，以prset-a質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，從prset-a 質(zhì)粒中去除T7 啟動子，反應(yīng)體系如表2 所述。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物回收步驟同1.2.1 步驟（1）。

1.2.4 DNA 的酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組子的篩選

（1） 酶切以綠色熒光基因（gfp） 為報告基因的Atu4856 啟動子序列。用BamHⅠ酶切含gfp的Atu4856 啟動子序列。按照酶供應(yīng)商提供的說明進(jìn)行消化。按照表3 添加消化反應(yīng)系統(tǒng)。消化反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫水浴中水浴加熱3 h。以非酶切序列為對照，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶產(chǎn)物，用試劑盒回收產(chǎn)物，并將其保存在-20 ℃條件下備用[8]。

酶切體系見表3。

表3 酶切體系/μL

（2） 去磷酸化和空載體酶切。用BamHⅠ酶切無T7 啟動子prset-a 的PCR 產(chǎn)物。消化反應(yīng)體系按表3混合，37 ℃下保溫3.5 h。電泳后回收1% （m/V）瓊脂糖凝膠，以防出現(xiàn)載體自連的現(xiàn)象[9]，將按照表4 中體系進(jìn)行載體去磷酸化。

載體去磷酸化體系見表4。

表4 載體去磷酸化體系/μL

（3） 連接。按照表5 所示的連接體系，將BamHⅠ酶切后的目的序列用T4 DNA Ligase 連接到BamHⅠ酶切后并去除磷酸化的載體上，于4 ℃下過夜連接，用于轉(zhuǎn)化。

連接體系見表5。

表5 連接體系/μL

（4） 轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。

（5） 重組子的篩選。挑取單菌落，用LB 培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，接著用BamHⅠ酶切、鑒定[10]。將與目的條帶大小相同的陽性克隆片段進(jìn)行測序，命名含有Atu4856 啟動子的重組質(zhì)粒，即prsetagfp1，并將此菌種進(jìn)行保存。

（6） 檢測探針載體的轉(zhuǎn)錄活性。挑取單菌落，用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在對數(shù)生長期時，對菌液進(jìn)行離心、沉淀清洗，制片，在放大倍數(shù)為×400 的倒置熒光顯微鏡下觀察是否有熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶有g(shù)fp 基因的Atu4856 啟動子序列擴(kuò)增

以pegfp-n1 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 特異性擴(kuò)增獲得大小約750 bp 的綠色熒光蛋白基因（gfp） （圖2）。設(shè)計(jì)搭橋PCR 引物，通過重疊延伸PCR，將gfp基因連接到Atu4856 啟動子序列（圖3），形成大小約1 225 bp 的嵌合基因片段，作為其是否具有啟動子基因轉(zhuǎn)錄活性的報告基因。

PCR 擴(kuò)增gfp基因電泳圖見圖2，PCR 擴(kuò)增帶有g(shù)fp的Atu4856 啟動子電泳圖見圖3。

圖2 PCR 擴(kuò)增gfp 基因電泳圖

圖3 PCR 擴(kuò)增帶有g(shù)fp 的Atu4856 啟動子電泳圖

2.2 PCR 擴(kuò)增無T7 啟動子的質(zhì)粒（prset-a）

模板采用質(zhì)粒prset-a，采用引物P1 和P2，通過PCR 擴(kuò)增得到不含T7 啟動子的質(zhì)粒prset-a，大小約2.7 kb（圖4），用于重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。

PCR 擴(kuò)增去除T7 啟動子的prset-a 質(zhì)粒電泳圖見圖4。

圖4 PCR 擴(kuò)增去除T7 啟動子的prset-a 質(zhì)粒電泳

2.3 酶切鑒定prset-agfp1 重組質(zhì)粒

將BamHⅠ酶切后帶有綠色熒光基因（gfp） 的Atu4856 啟動子連接在BamHⅠ酶切后的prset-a 載體上，該載體無T7 啟動子，接著轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌，培養(yǎng)過夜。經(jīng)過提質(zhì)粒、酶切、瓊脂糖凝膠電泳等一系列過程，驗(yàn)證與PCR 產(chǎn)物一致（圖5），同時將質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明prset-a 質(zhì)粒上成功插入了標(biāo)記基因（gfp） 的Atu4856 啟動子序列，載體構(gòu)建成功。

酶切鑒定prset-agfp1 重組質(zhì)粒電泳圖見圖5。

圖5 酶切鑒定prset-agfp1 重組質(zhì)粒電泳圖

2.4 驗(yàn)證Atu4856 啟動子在探針載體中的活性

取菌液制片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，發(fā)射藍(lán)光時有熒光，而只帶prset-a 載體的大腸桿菌沒有熒光現(xiàn)象（圖6）。說明與gfp基因融合的載體已被成功構(gòu)建，帶有熒光基因（gfp） 的Atu4856啟動子序列被證明具有轉(zhuǎn)錄活性。

未突變的含有495 bp Atu4856 上游序列重組質(zhì)粒E.coli（prset-agfp1） 的熒光觀察結(jié)果見圖6。

圖6 未突變的含有495 bp Atu4856 上游序列重組質(zhì)粒E.coli（prset-agfp1） 的熒光觀察結(jié)果

3 結(jié)論

啟動子是構(gòu)建基因表達(dá)載體的重要因素，對外源基因的表達(dá)水平具有著重要的影響。查閱大量文獻(xiàn)、進(jìn)行理論分析和試驗(yàn)工作，通過PCR 方法，獲得了編碼VBP3 蛋白Atu4856 基因的全長啟動子序列。將prset-a 載體的T7 啟動子與GFP 基因重組后，用Atu4856 啟動子序列取代，成功構(gòu)建了能在大腸桿菌中表達(dá)的啟動子探針載體，并利用熒光蛋白研究農(nóng)桿菌Atu4856 基因在大腸桿菌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。