李雙君 潘 君 崔玉紅**

（1）天津大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，天津 300350；2）重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）

自世界首次記錄心肌細(xì)胞存在鈣離子電流以來(lái)［1?2］，隨著膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)造與發(fā)展，越來(lái)越多的鈣離子電流和電壓門控鈣離子通道（voltage?gated calcium channel，VGCC）在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、腺細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等可興奮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)［3?4］，人們對(duì)于VGCC 的電生理特性和功能有了一定的認(rèn)識(shí)。VGCC通過(guò)細(xì)胞膜去極化激活，并通過(guò)響應(yīng)動(dòng)作電位和亞閾值去極化信號(hào)介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。鈣離子通過(guò)VGCC 進(jìn)入細(xì)胞，作為電信號(hào)的第二信使，在細(xì)胞內(nèi)的收縮、分泌、突觸傳遞和基因表達(dá)等事件中發(fā)揮重要作用［5］。隨著深入研究，VGCC 的各種不同亞型也被發(fā)現(xiàn)和定義，根據(jù)電生理學(xué)及藥理學(xué)特性不同，可將其分為：a.高電壓激活鈣離子通道，包括L、N、P/Q及R 型VGCC；b.低電壓激活鈣離子通道，只有T 型VGCC。VGCC 是跨膜蛋白復(fù)合體，由α1、β、α2δ、γ 4 個(gè)亞基組成。α1 亞基是VGCC 的主要亞基；β、α2δ、γ是輔助性亞基，用于調(diào)節(jié)α1亞基功能，從而改變鈣離子內(nèi)流數(shù)量（圖1）。目前，根據(jù)α1 亞基基因序列的同源性不同又可分為Cav1、Cav2、Cav3。其 中，Cav1 包 括Cav1.1 （α1S）、Cav1.2 （α1C）、Cav1.3 （α1D）、Cav1.4 （α1F），全部編碼L 型VGCC。Cav2 包括Cav2.1（α1A）、Cav2.2（α1B）、Cav2.3（α1E），分別編碼P/Q、N、 R 型VGCC。 Cav3 包 括Cav3.1 （α1G）、Cav3.2 （α1H）、Cav3.3 （α1I），全 部 編 碼T 型VGCC［6?7］。

Fig.1 The subunit structure and membrane topology of VGCC［5］圖1 VGCC的亞基結(jié)構(gòu)和膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［5］

對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等興奮性細(xì)胞而言，膜表面的離子通道尤其是VGCC是細(xì)胞興奮和功能發(fā)揮的分子基礎(chǔ)［3?4］。與諸多可興奮細(xì)胞不同的是，作為不可興奮細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞通常被認(rèn)為缺乏VGCC［8?11］。早在1980年代即有人通過(guò)電壓鉗或膜片鉗技術(shù)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［12?13］、牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)行電生理學(xué)研究［14?15］，發(fā)現(xiàn)它們不具有VGCC。到了1990年代，牛心房?jī)?nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞［16］、豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞［17］等也相繼被發(fā)現(xiàn)不存在VGCC。

然而，伴隨著熒光染色技術(shù)和數(shù)字成像顯微觀測(cè)技術(shù)的發(fā)展，這一長(zhǎng)期存在的觀點(diǎn)受到了挑戰(zhàn)。首先，1993年，Bkaily 等［18］發(fā)現(xiàn)人和成年雜種犬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在R型VGCC，同時(shí)也參與周圍細(xì)胞的興奮?分泌耦合過(guò)程，打破了由來(lái)已久的籠統(tǒng)共識(shí)。隨后，Lee 等［19］在1999年發(fā)現(xiàn)大鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC，Yazawa等［20］在2002年發(fā)現(xiàn)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC。眾多不同種類內(nèi)皮細(xì)胞不斷的被發(fā)現(xiàn)存在VGCC。

內(nèi)皮細(xì)胞是否存在VGCC？本文就VGCC在不同種類血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究進(jìn)展作以綜述。同時(shí)，相關(guān)研究表明內(nèi)皮細(xì)胞VGCC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自身的分泌、周圍細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞）的收縮和舒張以及遷移和增殖方面均有顯著的影響，本文也將進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 內(nèi)皮細(xì)胞的VGCC及分類

目前對(duì)于VGCC主要有3種檢測(cè)方法：

a.離子通道電流的檢測(cè)

VGCC由細(xì)胞膜去極化激活，產(chǎn)生鈣離子內(nèi)向電流。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，對(duì)膜片實(shí)行電壓鉗制，模擬細(xì)胞膜去極化。若測(cè)量到單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的電流，說(shuō)明VGCC存在；反之則不存在。通過(guò)觀測(cè)單個(gè)通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命、分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。其他幾個(gè)主要的鈣離子通道的激活均與膜電位變化無(wú)關(guān)，包括受體操縱鈣通道（receptor?operated Ca2+channel，ROC）、鈣池調(diào)控鈣通道（store?operated Ca2+channel，SOC）、機(jī)械敏 感 性 鈣 通 道（mechano?sensitive Ca2+channel，MS）等。

b.胞內(nèi)鈣離子濃度變化的檢測(cè)

VGCC激活的另一個(gè)特征是胞內(nèi)鈣離子濃度顯著提高。應(yīng)用VGCC 阻滯劑諸如地爾硫卓（diltiazem，DTZ）、依福地平（efonidipine）、硝苯地平（nifedipine）等對(duì)細(xì)胞膜已去極化的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理，利用fura?2、fluo?3 等熒光指示劑對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)行檢測(cè)。若阻滯劑處理后胞內(nèi)鈣離子濃度提高被阻斷，則表明VGCC存在。

c.離子通道基因、蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)

目前對(duì)VGCC 在基因和蛋白質(zhì)層面上有了深入的了解，認(rèn)為去極化激活鈣離子電流形成的分子基礎(chǔ)是編碼VGCC的基因家族，包括Cav1、Cav2、Cav3 等。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，不但可以檢測(cè)VGCC 通道是否表達(dá)，還可以從基因的角度明確通道類型，如Cav1.1 編碼L 型VGCC、Cav2.1 編碼P/Q 型VGCC、Cav3.1 編碼T 型VGCC等。另外，免疫組織化學(xué)染色法也可以對(duì)VGCC在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步觀察到通道在細(xì)胞膜上不同位置的分布特點(diǎn)。

根據(jù)探究問(wèn)題的不同，以上3種檢測(cè)方法還可以聯(lián)合使用。由于內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征因血管類型和血管范圍的不同而不同［21］。因此，就目前所調(diào)研的文獻(xiàn)而言，根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞所處組織不同分為以下4類分別進(jìn)行闡述其研究進(jìn)展。

1.1 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

20世紀(jì)80年代早期，由于技術(shù)手段上的困難，關(guān)于完整組織或培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中VGCC 存在與否的報(bào)道很少［12］。膜片鉗技術(shù)和熒光顯微技術(shù)的發(fā)展及培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞可用性的提高，使得眾多學(xué)者獲得了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC 的結(jié)論［12?13，22?23］。例如，Bregestovski等［12］在1988年采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和單通道膜片鉗技術(shù)研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)組胺的膜響應(yīng)，在宏觀或單通道水平上都沒(méi)觀察到電壓門控鈣離子電流，表明VGCC 不存在于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中。Niluus等［22］在1990年采用膜片鉗技術(shù)研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的離子通道，其電生理特性結(jié)果表明VGCC不存在。Vargas等［23］在1994年發(fā)現(xiàn)去極化的電壓鉗脈沖不能激活內(nèi)向電流，表明在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏VGCC。然而，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC的結(jié)論也有報(bào)道。2010年，Martini等［24］對(duì)血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）通過(guò)不同的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，結(jié)果表明Ang II通過(guò)T型VGCC和L型VGCC 調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度，但僅通過(guò)T型VGCC的鈣內(nèi)流調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，證實(shí)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞含有L和T型VGCC。

1.2 動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是否存在VGCC 的研究率先在動(dòng)物動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中開展。1987年，Johns 等［14］應(yīng)用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)去極化沒(méi)有激活內(nèi)向電流，這強(qiáng)烈表明在培養(yǎng)的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，沒(méi)有功能性電壓門控鈣或鈉通道。同年，Takeda等［25］在膜片鉗記錄中發(fā)現(xiàn)存在一種超極化激活的內(nèi)向電流和強(qiáng)烈的內(nèi)向整流，并且該細(xì)胞亞群的去極化過(guò)程沒(méi)有觀察到依賴電壓的鈣離子電流，因此推測(cè)出牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC。同樣應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，Colden?Stanfield 等［26］將細(xì)胞置于10 mmol/L或110 mmol/L 的氯化鈣中，電壓敏感的鈣電流沒(méi)有被激活，表明牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC。1989年，Bregestovski 等［13］也提到，牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的膜片鉗探測(cè)結(jié)果表明它們不存在VGCC。同年，Cannell等［15］將膜片鉗技術(shù)與Ca2+熒光顯微技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用于牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)去極化降低而不是增加胞內(nèi)Ca2+濃度，這有力地表明牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中不存在VGCC。1992年，Kimura等［17］對(duì)豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示VGCC不參與持續(xù)大量增加的胞內(nèi)鈣離子相關(guān)的細(xì)胞損傷的發(fā)生，表明豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC。1993年，Bkaily 等［18］應(yīng)用熒光染色技術(shù)和數(shù)字顯微技術(shù)對(duì)犬類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示K+去極化和血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）通過(guò)激活R 型VGCC 增加胞內(nèi)鈣離子濃度，表明犬類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在R 型VGCC。近幾年，關(guān)于動(dòng)物動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞VGCC的研究多見于鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。2017年，Gilbert等［27］應(yīng)用免疫熒光法的結(jié)果顯示野生型小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中存在與內(nèi)皮一氧化氮合酶共定位的Cav3.1通道。該研究表明，小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在T型VGCC，主要通過(guò)Cav3.1通道，控制內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+和乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）介導(dǎo)的舒張作用，促進(jìn)小鼠肺內(nèi)血管反應(yīng)。2020年，Cao 等［28］發(fā)現(xiàn)無(wú)Ca2+的Krebs 溶液顯著減弱了花椒毒素（xanthotoxin，XAT）誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管舒張，對(duì)大鼠主動(dòng)脈環(huán)應(yīng)用L型VGCC阻斷劑地爾硫卓預(yù)處理減弱了XAT 誘導(dǎo)的血管舒張，表明大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在L型VGCC。

人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是否存在VGCC 的研究相對(duì)動(dòng)物動(dòng)脈細(xì)胞而言開展較晚。1993年，Bkaily等［18］對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用fura?2 處理和數(shù)字成像顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在血小板活化因子刺激下顯著增加，并顯示出對(duì)L型VGCC阻滯劑硝苯地平（nifedipine）不敏感，但對(duì)R 型VGCC 阻滯劑伊拉地平（isradipine，PN200?110）敏感，從而得出存在R 型VGCC 的結(jié)論。2002年，Yazawa等［20］發(fā)現(xiàn)對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用米貝拉地爾（mibefradil），一種T 型VGCC 阻滯劑，能夠降低組胺誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度的提高，表明人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在T 型VGCC。2005年，Oshima等［29］發(fā)現(xiàn)依福地平，一種T 型和L 型Ca2+通道阻滯劑，可顯著改變內(nèi)皮功能指數(shù)FMD/NTG、8?OHdG的尿排泄量、血清丙二醛修飾的低密度脂蛋白即逆轉(zhuǎn)原發(fā)性高血壓患者的內(nèi)皮功能障礙，而L 型VGCC 阻滯劑硝苯地平對(duì)內(nèi)皮功能無(wú)改善作用，表明人肱動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在T型VGCC而非L型VGCC。進(jìn)一步，可以通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法和實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)使內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 的不同亞型和分布特點(diǎn)得以明確。例如，2017年，Thuesen等［30］應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法在人乳腺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到Cav2.1 和Cav3.1，在人大腦動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到Cav2.1，揭示了兩種不同類型的VGCC均參與人腦和乳腺血管的收縮活動(dòng)。

1.3 微血管內(nèi)皮細(xì)胞

不同于靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，微血管內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 存在與否的研究開展得較晚。Li等［31］在1999年發(fā)現(xiàn)激動(dòng)劑ATP（100 μmol/L）、凝血酶（10 U/ml）和組胺（100 μmol/L）能夠誘發(fā)人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)Ca2+濃度升高，該濃度的提高被受體操縱Ca2+通道阻滯劑所阻斷。然而電壓門控通道阻滯劑地爾硫卓并沒(méi)有阻止胞內(nèi)Ca2+濃度的提高。Li 等［31］進(jìn)一步用K+平衡鹽溶液（80 mmol/L） 去極化或使用VGCC 激動(dòng)劑BAY k8644 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示K+平衡鹽溶液（80 mmol/L）降低了組胺（100 μmol/L）誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高，表明人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC通道。

隨后，眾多研究集中于鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞。2004年，Wei 等［32］發(fā)現(xiàn)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)T型VGCC，該通道承擔(dān)由于流動(dòng)障礙介導(dǎo)的膜去極化而發(fā)生的Ca2+內(nèi)流。2006年，Townsley等［33］總結(jié)了Ca2+通道在肺內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，并指出大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞存在T 型通道。同年，Zhou等［34］討論了有關(guān)T型VGCC在肺內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和功能作用，闡述了內(nèi)皮細(xì)胞T型VGCC的分子特征、生物物理和藥理特征，并指出大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)了低電壓門控鈣通道（Cav3.1）。2007年，Proost 等［35］應(yīng)用雙免疫染色法發(fā)現(xiàn)Cav3.1 和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecular?1，PECAM?1，內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物），顯著地染色于內(nèi)皮細(xì)胞的側(cè)壁，少量染色了基壁和根尖壁，表明T 型VGCC 存在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中。2018年，Zheng 等［36］發(fā)現(xiàn)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞本身具有形成體外血管“網(wǎng)絡(luò)”能力，減少細(xì)胞外Ca2+可消除“網(wǎng)絡(luò)”的形成，但是阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGF receptor）或一氧化氮合酶的作用很小或沒(méi)有，說(shuō)明“網(wǎng)絡(luò)”形成是一個(gè)Ca2+濃度依賴的過(guò)程。阻斷T型VGCC或沉默α1G基因，破壞了“網(wǎng)絡(luò)”的形成。相反，阻斷瞬時(shí)受體電位通道4（canonical transient receptor potential 4，TRPC4）或辣椒素4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）這兩種鈣通道對(duì)“網(wǎng)絡(luò)”形成沒(méi)有影響，說(shuō)明大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞存在T 型VGCC［36］。2019年，Leo 等［37］研究發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰肌醇（L?alpha?lysophosphatidylinositols，LPI）可以促進(jìn)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流，但是通過(guò)應(yīng)用硝苯地平抑制L型VGCC或在無(wú)Ca2+鹽水中這種內(nèi)流被消除，表明該細(xì)胞存在L型VGCC。

1.4 其他內(nèi)皮細(xì)胞

盡管VGCC在內(nèi)皮細(xì)胞中存在與否的研究多開展于靜脈、動(dòng)脈、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其他一些組織器官的內(nèi)皮細(xì)胞是否存在VGCC 也有一些報(bào)道。例如，1990年，Laskey 等［16］將膜片鉗技術(shù)與Ca2+熒光顯微技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)劑刺激的Ca2+內(nèi)流僅僅是由于電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力的變化引起的，Ca2+通過(guò)一種與電壓無(wú)關(guān)的被動(dòng)滲透通路進(jìn)入細(xì)胞，表明牛心房?jī)?nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC。Vinet 等［38?39］應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛腎上腺髓質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞去極化產(chǎn)生了Ca2+內(nèi)向電流，并且其電流?電壓曲線結(jié)果表明細(xì)胞存在T型和L型VGCC。Lee等［19］對(duì)大鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用fura?2進(jìn)行熒光染色檢測(cè)的結(jié)果顯示血清素誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度變化與VGCC和無(wú)機(jī)鈣通道阻滯劑有關(guān)，這與一些有關(guān)VGCC參與激動(dòng)劑刺激Ca2+內(nèi)流的研究一致［40?41］，表明VGCC 存在于大鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞中。另外，T 型VGCC參與血管直徑的調(diào)節(jié)已經(jīng)在大鼠和小鼠的傳入和傳出小動(dòng)脈中被觀察到［42?45］，而L型VGCC被認(rèn)為在皮質(zhì)傳出小動(dòng)脈收縮中不發(fā)揮作用［46?48］。例如，2014年，Thuesen 等［49］對(duì)小鼠腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯示，Cav3.2通道和內(nèi)皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）阻斷劑抑制了去極化誘導(dǎo)的灌注傳出小動(dòng)脈收縮后的二次擴(kuò)張，因此Cav3.2 通道參與了一氧化氮（NO）依賴性的傳出小動(dòng)脈擴(kuò)張。

進(jìn)一步，可以通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法和實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)使得內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 的不同亞型和分布特點(diǎn)得以明確。例如，Blanks等［50］在2007年通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)，Cav3.1在部分人子宮肌層血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，而Cav3.2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞中表達(dá)，表明T型VGCC存在于人子宮肌層血管內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，本文統(tǒng)計(jì)了涉及靜脈、動(dòng)脈、微血管及其他一些內(nèi)皮細(xì)胞中VGCC 存在與不存在的研究結(jié)果，具體見表1。

Table 1 Research progress of voltage-gated calcium channels in endothelial cells表1 內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子電壓門控通道研究進(jìn)展

2 內(nèi)皮細(xì)胞VGCC的作用

2.1 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮舒張和收縮活動(dòng)

內(nèi)皮細(xì)胞遠(yuǎn)不只是血液和血管壁平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)蛋白之間的簡(jiǎn)單的物理屏障。內(nèi)皮細(xì)胞的多功能性使它們能夠調(diào)節(jié)血管張力的平衡和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)、釋放血管活性物質(zhì)，其中最重要的一種叫做內(nèi)皮衍生放松因子（endothelium?derived relaxing factor，EDRF），這些物質(zhì)導(dǎo)致皮下平滑肌松弛，并調(diào)節(jié)血液成分在血管壁上的流動(dòng)（滲透性）［51?53］。EDRF 被確定為NO，由精氨酸（arginine）通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮一氧化氮合酶形成，其釋放與胞內(nèi)游離鈣濃度的增加有關(guān)［40，54?55］。EDRF/NO 是血管平滑肌和血小板中可溶性冠苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）普遍存在的激活因子，它催化環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的產(chǎn)生，導(dǎo)致平滑肌松弛，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的舒張和收縮［56?57］（圖2a）。例如，小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過(guò)間隙連接通道交流物質(zhì)和電信號(hào)，產(chǎn)生協(xié)調(diào)效應(yīng)［27，58?59］。另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞的連接通透性，也受到NO的調(diào)控，通過(guò)Ca2+的增加而增強(qiáng)，可能是因?yàn)镃a2+對(duì)胞內(nèi)收縮元素的作用導(dǎo)致細(xì)胞間連接區(qū)域的收縮和間隙的擴(kuò)大［60?63］。因此，內(nèi)皮細(xì)胞的Ca2+調(diào)控的機(jī)制對(duì)于理解血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管張力和血管通透性的作用是至關(guān)重要的。

關(guān)于存在VGCC 的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究顯示VGCC對(duì)Ca2+的調(diào)控起到關(guān)鍵作用，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮的舒張和收縮活動(dòng)。例如，Oshima等［29］發(fā)現(xiàn)T型VGCC阻滯劑，通過(guò)降低氧化應(yīng)激改善原發(fā)性高血壓患者的血管內(nèi)皮功能障礙。Gackiere 等［64］在文章中表明被稱為容量性鈣進(jìn)入的通路（capacitative calcium entry，CCE）在非興奮性細(xì)胞中尤為重要，該通路是由鈣儲(chǔ)存耗盡所激活的。雖然這種鈣離子內(nèi)流通常被認(rèn)為是通過(guò)TRP 通道（一種非選擇性陽(yáng)離子通道）發(fā)生的，但通過(guò)使用T型VGCC拮抗劑米貝拉地爾抑制了CCE期間的鈣增加，表明T型VGCC可能有助于在儲(chǔ)存耗盡后的鈣離子進(jìn)入。另外，T型VGCC參與微血管直徑的調(diào)節(jié)已經(jīng)在大鼠和小鼠的傳入和傳出小動(dòng)脈中被觀察到［42?45］。例如，Cav3.2和內(nèi)皮一氧化氮合酶阻斷劑抑制了去極化誘導(dǎo)的灌注傳出動(dòng)脈收縮后的二次擴(kuò)張，表明Cav3.2參與了NO依賴性的傳出動(dòng)脈擴(kuò)張［49］。在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，Ca2+通道和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度控制著NO 等血管舒張因子的釋放，參與調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈血壓。免疫熒光標(biāo)記顯示野生型小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中存在與內(nèi)皮一氧化氮合酶共定位的Cav3.1通道。這表明T型VGCC主要通過(guò)Cav3.1通道，控制內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+和乙酰膽堿介導(dǎo)的舒張作用，促進(jìn)小鼠肺內(nèi)血管反應(yīng)［27］。此外，L、P/Q和T型VGCC存在于人腎內(nèi)動(dòng)脈，并參與去極化誘導(dǎo)的血管收縮［49，65］，但不同亞型鈣通道在其他類型人動(dòng)脈中的重要性尚不清楚［50］。值得注意的是，T型VGCC對(duì)血管張力的控制在病理?xiàng)l件下也發(fā)揮了關(guān)鍵作用［66?68］。例如，T型VGCC在肺毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，參與炎癥過(guò)程，包括血管性血友病因子的分泌、P選擇素的表面轉(zhuǎn)移或炎癥的肺微循環(huán)中鐮狀紅細(xì)胞介導(dǎo)的血管阻塞［69?70］。然而，T型VGCC在大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管舒張中的作用卻鮮為人知。例如，在表達(dá)T 型VGCC（Cav3.1）的小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，在非生理KCl去極化劑的刺激下，T 型VGCC 會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈二次舒張［71］。

2.2 影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖

血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移在損傷愈合、血管生成等生理過(guò)程中起著重要作用［29，72］。Ca2+是內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖過(guò)程中多種信號(hào)的重要信使［73］。作為Ca2+內(nèi)流重要途經(jīng)的VGCC，其與內(nèi)皮細(xì)胞遷移關(guān)系的研究卻很少。Martini等［24］利用改進(jìn)的博伊登室（Boyden chamber）系統(tǒng)對(duì)Ang II 刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。目的是探究Ang II是否通過(guò)VGCC刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣內(nèi)流，以及這種內(nèi)流是否在細(xì)胞遷移中起作用。Ang II通過(guò)作用于AT1和AT2受體位點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)作用。AT1拮抗劑ZD7155 阻斷了鈣對(duì)Ang II 的反應(yīng)，而AT2拮抗劑PD?123319沒(méi)有表現(xiàn)出這種作用。對(duì)其應(yīng)用T型VGCC阻滯劑米貝拉地爾和L型VGCC阻滯劑維拉帕（verapamil）進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)只有前者才會(huì)顯著減少遷移細(xì)胞的數(shù)量。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移僅通過(guò)T型VGCC的鈣內(nèi)流調(diào)節(jié)，這種作用是由Ang II?AT1受體途徑介導(dǎo)的。Wang等［74］進(jìn)一步研究了Ang II對(duì)T型VGCC表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Ang II通過(guò)AT1受體、Ras和MEK誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中T 型VGCC α1G 亞基的表達(dá)。Ang II 誘導(dǎo)的α1G表達(dá)是由AT1 受體介導(dǎo)的，這一結(jié)果與Martini等［24］研究一致。重要的是，Ras和MEK通路參與了該過(guò)程。應(yīng)用阿托伐他?。╝torvastatin），抑制法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的產(chǎn)生，阻止Ras激活，阻斷了Ang II誘導(dǎo)的α1G的表達(dá)。此外，為了確定MEK1/2的激活是否參與Ang II 誘導(dǎo)的α1G 表達(dá)，應(yīng)用MEK1/2 抑制劑PD98059對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，同樣抑制了Ang II 誘導(dǎo)的α1G 表達(dá)。這些結(jié)果表明，Ang II 通過(guò)AT1受體介導(dǎo)的Ras/MEK通路誘導(dǎo)α1G表達(dá)。

Fig.2 Function of VGCC in endothelial cells圖2 內(nèi)皮細(xì)胞VGCC功能

Zheng 等［75］采用了傷口愈合試驗(yàn)來(lái)測(cè)試T 型VGCC 阻滯劑是否影響肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVEC）遷移。該試驗(yàn)首先培養(yǎng)PMVEC 生長(zhǎng)至匯合，通過(guò)刮擦細(xì)胞單層形成間隙，然后在缺乏血清的條件下進(jìn)行監(jiān)控，保證了缺口閉合的過(guò)程主要由細(xì)胞遷移構(gòu)成。結(jié)果顯示，T 型VGCC 阻滯劑NNC 55?0396或使α1G基因沉默會(huì)使間隙閉合分別延遲多達(dá)32%和28%。顯然，T型VGCC阻滯顯著影響了PMVEC的遷移，表明VGCC在內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［75］。另外，PMVEC本質(zhì)上具有體外生成血管“網(wǎng)絡(luò)”的能力［75］。耗盡細(xì)胞外鈣離子，消除了“網(wǎng)絡(luò)”的形成，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體或一氧化氮合酶的阻斷作用很小或沒(méi)有作用，表明“網(wǎng)絡(luò)”形成是鈣離子依賴性過(guò)程。阻斷T 型VGCC 或沉默α1G（PMVEC 中表達(dá)的唯一VGCC）破壞“網(wǎng)絡(luò)”形成。從機(jī)制上講，T型VGCC通道阻滯劑以劑量依賴性方式降低Akt磷酸化。阻斷Akt 或其上游激活劑磷脂酰肌3?激酶（PI3K），也會(huì)損害“網(wǎng)絡(luò)”形成。T型VGCC道阻斷的后果不單單是體外“網(wǎng)絡(luò)”形成的破壞，還顯著降低了細(xì)胞增殖、細(xì)胞基質(zhì)粘附和細(xì)胞遷移。因此，T 型VGCC 阻斷明顯破壞了PMVEC 血管生成活性的多個(gè)組成部分。這些發(fā)現(xiàn)表明α1G型VGCC可通過(guò)PI3K?Akt 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的血管生成潛力。參考以上研究，我們繪制了內(nèi)皮細(xì)胞VGCC影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖的功能圖（圖2b）。

值得注意的是，VGCC在許多其他細(xì)胞遷移過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。例如，Nebe等［76］發(fā)現(xiàn)T型VGCC阻滯劑米貝拉地爾而不是L型VGCC阻滯劑氨氯地平（amlodipine）和維拉帕米在體外減弱了白細(xì)胞黏附，表明T型VGCC參與了白細(xì)胞遷移過(guò)程。Agabiti?Rosei 等［77］發(fā)現(xiàn)L 型VGCC 阻滯劑拉西地平（lacidipine）可以顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠小阻力動(dòng)脈內(nèi)膜?中膜比例，表明VGCC 對(duì)平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖有巨大的影響。Blaheta 等［78］觀察到米貝拉地爾對(duì)淋巴細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)和滲透的抑制作用，進(jìn)一步展示VGCC 對(duì)細(xì)胞遷移的顯著影響。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞遷移過(guò)程中VGCC的功能作用和對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的依賴。盡管目前VGCC與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖關(guān)系的研究很少，其調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全了解，但是上述發(fā)現(xiàn)可以為兩者關(guān)系的研究提供思路。有理由相信VGCC 會(huì)發(fā)揮重要作用，因此，未來(lái)應(yīng)擴(kuò)大和加深VGCC與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖關(guān)系的研究。

2.3 響應(yīng)應(yīng)力或應(yīng)變

VGCC通過(guò)響應(yīng)力或應(yīng)變的變化調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度。微血管內(nèi)皮細(xì)胞常受到機(jī)械力的作用，包括血管內(nèi)壓力產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)變和與血流相關(guān)的剪切應(yīng)力［79?80］。Yoshikawa等［81?82］對(duì)剪切應(yīng)力刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）造成胞內(nèi)Ca2+濃度變化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在ATP存在的情況下，剪切應(yīng)力導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而在缺乏ATP或存在非特異性Ca2+通道阻滯劑Ni2+的情況下，則觀察不到這種反應(yīng)。這是因?yàn)榉翘禺愋訡a2+通道阻斷劑Ni2+可消除剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca2+瞬變，表明Ca2+內(nèi)流是產(chǎn)生胞內(nèi)Ca2+瞬態(tài)變化的主要原因［82］。然而，由于應(yīng)用的是非特異性Ca2+通道阻滯劑，因此不能判斷出是何種鈣離子通道在內(nèi)流中發(fā)揮作用。此外，Isshiki 等［83］發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力可以誘導(dǎo)胎牛胸降主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化。然而，產(chǎn)生濃度變化的Ca2+是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的，與膜上的Ca2+通道無(wú)關(guān)。盡管其他一些研究發(fā)現(xiàn)缺血早期時(shí)原位大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞感受到剪切應(yīng)力減少，緊接著細(xì)胞膜去極化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，隨后胞內(nèi)Ca2+濃度升高［79?80，84］，上述研究只建立了應(yīng)力變化與胞內(nèi)Ca2+濃度變化的相關(guān)性，并未將應(yīng)力、應(yīng)變與VGCC聯(lián)系起來(lái)。

關(guān)注于缺血或剪切應(yīng)力變化導(dǎo)致的膜去極化與胞內(nèi)Ca2+濃度變化過(guò)程的相關(guān)研究，則解釋了應(yīng)力變化、VGCC、胞內(nèi)Ca2+三者之間的潛在關(guān)系。起初，Tozawa等［85］用膜電位調(diào)節(jié)劑和ROS抑制劑對(duì)膜去極化、ROS的產(chǎn)生與Ca2+內(nèi)流的關(guān)系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。研究表明缺血導(dǎo)致膜去極化，其中K+通道失活是膜去極化的機(jī)制，這是肺內(nèi)皮細(xì)胞缺血的最初表現(xiàn)。應(yīng)用克羅卡林（cromakalim），一種K+通道開放器，可以使內(nèi)皮細(xì)胞膜超極化，減弱了缺血誘導(dǎo)的去極化，并抑制缺血期間Ca2+的增加。這表明，內(nèi)皮細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加。因此，Ca2+內(nèi)流可能是由VGCC 介導(dǎo)的，VGCC 被缺血誘導(dǎo)的膜去極化激活。需要注意的是，許多報(bào)道表明VGCC在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中不存在，是由于在靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)丟失這些通道，但暴露于剪切應(yīng)力的原位肺內(nèi)皮細(xì)胞擁有這些通道［85］。

進(jìn)一步，Song等［86］明確了缺血開始后內(nèi)皮細(xì)胞變化與時(shí)間的關(guān)系。第1秒內(nèi)發(fā)生膜去極化，1～2 s 檢測(cè)到血管內(nèi)H2O2增加，10～15 s 之間細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。該時(shí)間關(guān)系表明內(nèi)皮細(xì)胞在缺血后按順序發(fā)生了以下一系列事件：膜去極化、H2O2生成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加和NO 生成。細(xì)胞對(duì)缺血的快速有序響應(yīng)表明剪切應(yīng)力通過(guò)合適的“傳感器”在內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。Chatterjee 等［87］給出了“傳感器”的構(gòu)成及作用，并總結(jié)了內(nèi)皮細(xì)胞感受剪切應(yīng)力變化并傳遞信號(hào)的過(guò)程。實(shí)際上，剪切應(yīng)力改變是缺血的一種表現(xiàn)。血流的停止是由一個(gè)位于內(nèi)皮細(xì)胞小窩的“ 機(jī)械小體（mechanosome）”感受到的，該小體由血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏連蛋白（VE cadherin）等構(gòu)成［88］。機(jī)械小體的激活導(dǎo)致Katp通道關(guān)閉，引起內(nèi)皮細(xì)胞膜的去極化。胞膜去極化還導(dǎo)致T 型VGCC 的打開，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，一氧化氮合酶的激活和NO 的生成。由于流動(dòng)的刺激使機(jī)械小體保持激活和Katp通道開放，可以認(rèn)為機(jī)械小體既能感知剪切的開始也能感知剪切的停止，它應(yīng)該以O(shè)ff?On 狀態(tài)存在。Off?On模式如何打開或關(guān)閉K+通道目前還不清楚。另外，目前機(jī)械小體工作的確切機(jī)制也不是很清楚，仍需要后續(xù)的研究工作來(lái)揭示。

參考以上研究，本文總結(jié)了內(nèi)皮細(xì)胞VGCC響應(yīng)應(yīng)力、應(yīng)變的功能圖（圖2c）。

2.4 其他作用

盡管內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 的主要作用體現(xiàn)在調(diào)節(jié)內(nèi)皮舒張和收縮、響應(yīng)應(yīng)力或應(yīng)變等方面，仍有一些其他的作用被發(fā)現(xiàn)（圖2d）。一些遞質(zhì)、激素激活的離子通道具有胞內(nèi)游離鈣濃度依賴的特性。例如，激活劑為緩激肽的鉀離子通道的開閉，受胞內(nèi)鈣離子濃度變化的激活；激活劑為組胺的陽(yáng)離子通道的開閉，依賴于胞內(nèi)鈣離子的存在；Mn2+/Ca2+通道的開閉，依賴于胞內(nèi)鈣離子的存在，并被肌醇1,3,4,5?四磷酸激活（IP4，一種IP3 的代謝產(chǎn)物）。其中VGCC 作為細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)控的關(guān)鍵通道參與了以上受體、配體的結(jié)合及通道的門控［89］。另外，VGCC 在內(nèi)皮細(xì)胞激活?分泌耦合機(jī)制中起著重要作用。Bkaily 等［18］發(fā)現(xiàn)血小板活化因子誘導(dǎo)刺激胞內(nèi)鈣濃度的變化以及血管內(nèi)皮細(xì)胞隨后釋放血管活性因子，如內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子和內(nèi)皮素1是通過(guò)激活R型VGCC介導(dǎo)的。

3 討 論

目前，除VGCC 外，在內(nèi)皮細(xì)胞膜表面還存在多種鈣離子通道，包括鈣池調(diào)控鈣通道、環(huán)核苷酸門控性離子通道（cyclic nucleotide?gated channels，CNG）、瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential channel，TRP）、嘌呤堿樣受體門控性陽(yáng)離子通道（purinergic ligand?gated receptor?channel，P2X）等。這些離子通道通過(guò)影響鈣信號(hào)，在多種生理和病理過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。例如，Shalom等［90］發(fā)現(xiàn)環(huán)核苷酸門控性離子通道可在超極化狀態(tài)下開放，并在調(diào)節(jié)NO分泌水平方面起重要作用。Freichel 等［91］發(fā)現(xiàn)，TRPC4 缺陷型小鼠的動(dòng)脈環(huán)，對(duì)乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張反應(yīng)不敏感。原因是在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，TRPC4 的缺失會(huì)使ATP 和乙酰膽堿誘發(fā)的鈣內(nèi)流減少。該內(nèi)流會(huì)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生舒血管活性物質(zhì)，如NO、內(nèi)皮源性超極化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF）和前列環(huán)素，從而降低血管緊張度。另外，已有很多關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞存在P2X 的研究報(bào)道，并且肯定了P2X4 和P2X7 在內(nèi)皮細(xì)胞分布的普遍性［92］。

需要注意的是，盡管VGCC 同上述其他一些胞膜鈣通道均在諸多生理或病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是誘發(fā)方式卻有很大不同。VGCC由膜電位改變的方式特異性誘發(fā)，而鈣池調(diào)控鈣通道是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣庫(kù)耗竭觸發(fā)的一種外鈣內(nèi)流通道；環(huán)核苷酸門控性離子通道是一種與cAMP及cGMP直接結(jié)合后激活的離子通道；嘌呤堿樣受體門控性陽(yáng)離子通道為一種嘌呤堿樣的受體門控性陽(yáng)離子通道，與胞外ATP 結(jié)合時(shí)被打開，允許Na+和Ca2+等陽(yáng)離子通過(guò)；瞬時(shí)受體電位通道由ATP、內(nèi)皮素、乙酰膽堿、多種生長(zhǎng)因子、溫度、膜張力等諸多因素激活?？梢钥吹?，僅VGCC 由膜電位變化激活，其他通道大多為受體配體結(jié)合的方式激活。因此，在某些特定生理環(huán)境或體外培養(yǎng)條件下，可以通過(guò)控制誘發(fā)因素的方式特定的研究某一種通道的特性及功能。

通過(guò)結(jié)合生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物物理等方法，對(duì)復(fù)雜的內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 系統(tǒng)的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。然而，該領(lǐng)域目前所研究的內(nèi)皮細(xì)胞VGCC 的種類不是很多，機(jī)制上闡明的也不是很透徹。目前，最主要問(wèn)題是現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示VGCC表達(dá)存在顯著的類型異質(zhì)性。例如，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC［12?13，22?23］，而人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人肱動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人乳腺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC［18，29?30］。這可能與動(dòng)靜脈差異有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征因血管類型和血管范圍的不同而不同［21］。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胚胎性質(zhì)不同于成人組織細(xì)胞，臍靜脈執(zhí)行動(dòng)脈功能，如將氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤運(yùn)送到胎兒，而它的血壓和氧張力與靜脈很接近［93］。因此，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞電生理特征可能主要由胚胎起源和微環(huán)境的局部效應(yīng)決定，而不是嚴(yán)格由血管大小決定。此外還關(guān)注到，同為主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC而牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在［14?15，18］；牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不存在VGCC 而小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存在VGCC［13，27］。造成這些差異的原因尚不清楚，但可能與物種間多態(tài)性有關(guān)，或許僅僅是由于培養(yǎng)條件的差異。

另外，早期對(duì)VGCC 的研究多為電生理學(xué)研究，采用膜片鉗技術(shù)。盡管膜片鉗技術(shù)有很強(qiáng)的記錄分析功能，然而單純應(yīng)用仍遠(yuǎn)不足以研究、解釋內(nèi)皮細(xì)胞活動(dòng)的許多現(xiàn)象。因此，出現(xiàn)了與其他技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用：膜片鉗技術(shù)與顯微熒光測(cè)鈣技術(shù)相結(jié) 合［15?16，94］；顯 微 熒 光 測(cè) 鈣 技 術(shù) 與PCR 相 結(jié) 合等［28，33，94］。考慮到VGCC肩負(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的作用，對(duì)Ca2+的測(cè)量顯得尤為重要。直到今天，最突出的Ca2+指示劑為fura?2，一種比例計(jì)量化學(xué)熒光Ca2+敏感染料，適合觀測(cè)全細(xì)胞Ca2+濃度的改變［95］。然而，與所有化學(xué)熒光指標(biāo)相比，fura?2具有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)，包括紫外線激發(fā)引起的光毒性、亞細(xì)胞靶向困難和對(duì)活體動(dòng)物的適用性差。鑒于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)具有適于定量分析、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，科學(xué)家們發(fā)展了基于FRET 的基 因 編 碼探針（FRET?based GEPs）。Miyawaki等［96］在1997年成功設(shè)計(jì)了世界上第一個(gè)基于FRET 的基因編碼Ca2+指示劑Cameleons。如今，這種指示劑的種類變化繁多。對(duì)不同細(xì)胞器具有不同Ca2+敏感性的變種也已產(chǎn)生。最常用的探針包 含 D1、 D2cpV、 D3cpV、 4mtD1GO?Cam、D1ERCmR2 等［96?98］。未來(lái)VGCC 的研究工作也許可以考慮對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段給予更多的關(guān)注和思考，更多應(yīng)用諸如基因編碼檢測(cè)技術(shù)、膜片鉗技術(shù)、顯微熒光測(cè)鈣技術(shù)等技術(shù)的結(jié)合對(duì)鈣離子進(jìn)行測(cè)量，以提高結(jié)果的精確性。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，本文回顧了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞等主要內(nèi)皮細(xì)胞中VGCC 存在與否的研究成果。同時(shí)，本文探討了VGCC在血管內(nèi)皮舒張和收縮活動(dòng)、細(xì)胞遷移和增殖、響應(yīng)應(yīng)力或應(yīng)變等生理活動(dòng)中發(fā)揮的作用。

隨著科學(xué)技術(shù)和內(nèi)皮細(xì)胞功能知識(shí)的發(fā)展，對(duì)VGCC和Ca2+動(dòng)力學(xué)的理解顯著加強(qiáng)，其電生理特性也被周知，其通過(guò)VGCC調(diào)控興奮性、分泌、遷移是內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵機(jī)制。一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移在傷口愈合、動(dòng)脈粥樣硬化和血管生成等生理過(guò)程中起著重要作用［71］。另外一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和收縮通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移和血漿蛋白的滲漏直接影響炎癥反應(yīng)［99］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化可能是調(diào)控內(nèi)皮屏障功能的關(guān)鍵信號(hào)，以應(yīng)對(duì)滲透性增強(qiáng)劑，如緩激肽和凝血酶［100?101］。因此，對(duì)VGCC的深入而廣泛的研究對(duì)揭示并治療諸如原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等內(nèi)皮功能性疾病有著十分重要的意義。值得注意的是，受體門控通道激活與內(nèi)皮源產(chǎn)物的釋放有關(guān)，也與VGCC產(chǎn)生的離子電流有關(guān)。這兩個(gè)過(guò)程之間的聯(lián)系也將為未來(lái)研究提供一個(gè)重要方向。