林培雙 王 寒 祝令香 貝 蕾 黃 江 趙雯婷** 李彩霞1，**

（1）貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2）公安部物證鑒定中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室，北京 100038；3）新羿制造科技有限公司，北京 100038）

單 核 苷 酸 多 態(tài) 性 （single nucleotide polymorphism，SNP）是繼短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）之后的第三代法醫(yī)遺傳標記，指由單個核苷酸變異所形成的DNA序列多態(tài)性［1］。與STR 相比，SNP 在人類基因組中數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定［2］，不僅可用于個體識別和親子鑒定，還能用于刻畫生物檢材來源人的族群地域、體貌特征等表型［3?5］，從而快速鎖定犯罪嫌疑人范圍，輔助案件偵查。

法醫(yī)現(xiàn)場生物檢材的DNA 存在微量、降解、污染等問題，因此對檢驗方法的靈敏度、穩(wěn)定性、抗抑制性要求較高。目前法醫(yī)SNP 檢驗平臺包括毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）、質(zhì)譜、二代測序、芯片檢測等，其中微測序結(jié)合毛細管 電 泳 檢 測（SNaPshot）［6］或 飛 行 時 間 質(zhì) 譜（MALDI?TOF MS）［7］是當前法醫(yī)DNA實驗室常用的檢驗方法，但這兩種方法檢測時間長達7～10 h，操作步驟繁瑣，對抑制劑不耐受，而二代測序和芯片檢測對樣本DNA 質(zhì)和量要求高，耗時更長（＞24 h），操作復(fù)雜且成本更高，很難在法醫(yī)DNA基層 實 驗 室 大 范 圍 推 廣［8］。數(shù) 字PCR （digital polymerase chain reaction，dPCR）在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)出靈敏度高、特異性強、操作簡便快捷的優(yōu) 勢［9?11］，但 在 法 醫(yī)DNA 檢 驗 領(lǐng) 域 的 應(yīng) 用 研 究較少。

dPCR 主要分微滴式和芯片式兩種，其中微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的應(yīng)用更廣泛［12］。ddPCR 的工作原理為：首先在PCR 擴增反應(yīng)前將包含模板的常規(guī)PCR體系通過“油包水”形式微滴化處理，以實現(xiàn)數(shù)萬個微反應(yīng)體系的平行擴增，然后通過探針法檢測各微滴終點熒光信號值，最后根據(jù)陰陽性統(tǒng)計結(jié)果和熒光類型判斷SNP分型［13］。這種微滴化處理技術(shù)有效地降低了非目標物質(zhì)干擾，提高目標物質(zhì)的檢測。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，EPAS1基因上的5?SNP單倍型在高原與平原人群中的分布有顯著差異［14］。本實驗室前期構(gòu)建了5?SNP 單倍型的SNaPshot 檢測體系［15?16］，體系的靈敏度和特異性符合法醫(yī)學(xué)檢驗需求，但檢測周期長，對陳舊、接觸及含抑制劑類（環(huán)境污染）檢材的檢出率較低。本研究在國產(chǎn)新羿TD?1 ddPCR 平臺上，利用TaqMan 雙探針法，建立了5?SNP 單倍型的ddPCR 檢測體系，從準確性、穩(wěn)定性、靈敏度、檢材適應(yīng)性及抗抑制性等方面對其性能進行了評估，分析了ddPCR 在法醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用效果和價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

本研究檢測70份無關(guān)個體DNA樣本，來源于國家科技資源共享服務(wù)平臺計劃項目（YCZYPT［2017］01?3）。采集實驗室人員（編號SY）的8種不同類型檢材：血卡、血紗布、唾液、口腔拭子、帶毛囊頭發(fā)、煙頭和兩種接觸性檢材（瓶口和手機屏幕擦拭物）。9948 標準品DNA 購自蘇州新海生物科技股份有限公司。本研究已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會審查（編號：2017?001），所有參與者均簽署了書面知情同意書。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

微滴數(shù)字PCR 儀（中國新羿制造科技有限公司，TD?1）；PCR擴增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，A300）；微量紫外分光光度計（美國Nano Drop 公司，ND?2000c）；旋渦振蕩器（中國其林貝爾公司，QL?866）；高速離心機（德國Eppendorf公司，Centrifuge 5804 R）。

1.1.3 樣本DNA提取

采用QIAamp?DNA Mini M48 試劑盒（德國，QIAGEN 公司）提取檢材DNA，ND?2000c 分光光度計定量，并稀釋至0.5 μg/L。

1.1.4 SNP位點信息

選取前期已發(fā)表文獻［16］中EPAS1 基因上5 個SNP 位點，各位點名稱、位置、等位基因信息見表1。

Table 1 The information of 5-SNP haplotype of the EPAS1 gene

1.2 方法

1.2.1 引物探針設(shè)計與合成

從Ensemble dbSNP 數(shù)據(jù)庫下載各位點基因組序列，分別用Primer Premier 5.0 和Primer Express 3.0 軟件設(shè)計引物和探針。各SNP 位點設(shè)計兩條位點特異性TaqMan探針，分別用FAM和VIC熒光標記修飾。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物和探針序列信息見表2。

Table 2 The primer and probe information for 5-SNP used in ddPCR

1.2.2 ddPCR體系和程序

ddPCR 反應(yīng) 體系：2×ddPCR SuperMix （含UNG） 15 μl，10 μmol/L 上 下游 引物 各1.5 μl，10 μmol/L 的FAM 和VIC 標記探針各0.9 μl，DNA模板（基因組DNA）1 μl，蒸餾水補足至終體積30 μl；配置體系加至微滴生成芯片水相孔，180 μl微滴生成油加入油相孔進行微滴生成，然后進行ddPCR 擴增。反應(yīng)程序設(shè)置：95℃10 min；94℃30 s，58℃1 min， 40 個循環(huán)；12℃5 min。擴增結(jié)束后，使用微滴分析儀進行數(shù)據(jù)讀取。采用Chip Reader 軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)生成數(shù)據(jù)提取檢測位點FAM 和VIC 通道對應(yīng)陽性和陰性熒光信號均值，計算位點FAM 和VIC 兩通道對應(yīng)AMSI（absolute mean signal intensities）值，即檢測位點對應(yīng)陽性熒光信號均值減去陰性熒光信號均值［17］。

FAM 和VIC 通道判斷陽性標準：a. 信噪比，檢測位點AMSI值與該位點空白對照背景熒光信號均值比值（ratio 值） ＞1，排除假陽性信號；b.AMSI＞1 000；c.陽性微滴數(shù)≥4。同時滿足上面3個條件時，該位點對應(yīng)通道可判斷為陽性。

分型標準：a. 雜合子，F(xiàn)AM 和VIC 兩通道均滿足陽性判斷標準；b.純合子，當僅有一個通道滿足陽性判斷標準。

1.2.3 SNaPshot檢測流程

基于SNaPshot 技術(shù)的5?SNP 分型檢測流程、體系和PCR擴增程序均參照文獻［15］。

1.2.4 引物探針特異性

測試5個位點均為純合子的樣本9948標準品和102T，5 個位點均為雜合子的樣本NY20，各位點均設(shè)立空白對照。

1.2.5 體系性能評估

a.準確性。ddPCR 檢測26 份樣本和9948 標準品DNA，同時委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger測序，比較分型結(jié)果的一致性。

b.穩(wěn)定性。選取雜合樣本（編號NY20）對各位點重復(fù)檢驗3次，熒光信號檢測在兩張芯片內(nèi)完成，評估在同一芯片和不同芯片檢測分析中分型一致性和熒光信號波動情況，熒光值穩(wěn)定性以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）≤25%衡量［18］。

c. 靈敏度。將9948 標準品DNA 梯度稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 和0.031 25 ng，各濃度重復(fù)檢測3次，評估5個SNP位點均準確分型時的最低模板用量。

d.法醫(yī)檢材適應(yīng)性。為驗證平臺是否適應(yīng)法醫(yī)各類型案件檢材，采用實驗室人員（編號SY）模擬的8 種不同類型檢材DNA，含血卡、血紗布、唾液、口腔拭子、帶毛囊頭發(fā)、煙頭以及兩種接觸性檢材。其中接觸性檢材1是瓶口擦拭物，接觸性檢材2 是手機屏幕擦拭物，均采用干棉簽擦拭獲取。各類型檢材設(shè)置3次重復(fù)實驗。

e. 抗抑制能力。為適應(yīng)法醫(yī)現(xiàn)場檢材的特殊性［19?20］，選取常見抑制劑血紅素（hematin）、腐植酸（humic acid）和靛藍（indigo），按1.2.2和1.2.3實驗流程分別進行檢驗。血紅素濃度稀釋至350、700、1 050、1 400 μmol/L；腐植酸濃度稀釋至150、200、250、300 μg/L；靛藍濃度稀釋至150、200、250、300 mmol/L；各濃度取1 μl替代原體系蒸餾水。 實驗樣本選取9948 標準品DNA（0.5 μg/L），每次實驗將不加抑制劑體系作為標準陽性對照，并設(shè)立空白對照，每個濃度重復(fù)檢測1次。

f. 樣本測試。檢測70 份具有明確海拔信息的樣本（表3），使用PHASE v2.1.1 軟件（10 000 interactions，10?step thinning interval，和10 000 burn?ins）分析樣本所有組合單倍型［14］，評估樣本高原適應(yīng)性。

Table 3 Information of test population samples

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用Shapiro?Wilk 檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，利用t 檢驗分析數(shù)據(jù)；當P＜0.05時，表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism和Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性

采用5個SNP位點對應(yīng)的3種基因分型樣本和空白對照驗證引物探針特異性。各位點引物探針組合僅對其正確分型樣本產(chǎn)生陽性擴增信號：9948標準品每個位點僅VIC 通道檢測陽性信號，102T樣本每個位點僅FAM通道檢測陽性信號，NY20樣本FAM 和VIC 兩通道均顯現(xiàn)陽性信號（圖1）。圖2顯示，各樣本檢測陽性微滴簇聚集緊湊，與背景信號區(qū)分明顯；空白對照（no template control，NTC）未檢出非特異陽性擴增信號，表明引物探針可以特異的區(qū)分5個SNP位點的兩種等位基因。

Fig.1 AMSI and ratio data of the specificity verification for each SNP

Fig.2 2D ddPCR flourescence signal map of the specificity verification for each SNPThe Y?axis presents FAM signal(blue)and X?axis presents VIC signal(green);the gray dots present double?negative droplets;the orange dots present double?positive droplets;NTC presents no template control.

2.2 體系性能評估

2.2.1 準確性

ddPCR 體系共計測試27 份樣本DNA 獲得135個基因型，所有位點分型均滿足陽性判讀標準，檢出率100%，與Sanger測序結(jié)果一致率為100%。

2.2.2 穩(wěn)定性

雜合樣本（編號NY20）各位點3 次重復(fù)實驗檢測總微滴數(shù)處于33 389～51 450之間（＞30 000個微滴），保證ddPCR 實驗結(jié)果分析的準確性。表4數(shù)據(jù)分析顯示，F(xiàn)AM 和VIC 通道陽性熒光信號值相對穩(wěn)定，兩通道熒光信號均值的變異系數(shù)均≤10%；各位點檢測分型結(jié)果一致，均判讀為雜合子。所以平臺微滴生成穩(wěn)定，構(gòu)建的體系穩(wěn)定性及重復(fù)性良好。

Table 4 Repeatability detection of sample NY20 to each SNP

2.2.3 靈敏度

對0.5、0.25、0.125、0.062 5 和0.031 25 ng 共5 個梯度9948 標準品DNA 進行ddPCR 檢測。如圖3所示，當DNA模板量≥0.062 5 ng時，各位點檢測信號均達陽性標準，且不同DNA 模板量間的檢測信號值無顯著差異性（P＞0.05）。但當DNA模板量為0.031 25 ng時，個別位點檢測信號與0.5 ng比較明顯降低（P＜0.05），且rs73926264、rs55981512兩位點信號未達陽性標準。附件表S1顯示，陽性微滴數(shù)目隨著DNA模板量的降低而減少：當DNA模板量為0.031 25 ng 時，rs73926264 位點有1 次未檢出陽性微滴，信號丟失，無法判型。因此，ddPCR體系的最低DNA檢出量為0.312 5 ng（0.062 5 ng×5個SNP位點）。

2.2.4 法醫(yī)檢材適應(yīng)性

檢測編號SY的8種類型檢材是血卡、血紗布、唾液、口腔拭子、帶毛囊頭發(fā)、煙頭、瓶口和手機屏幕擦拭物（脫落細胞）。由圖4 可見，不同檢材位點檢測信號強度可能存在差異（P＜0.05），但這種信號差異未影響位點分型判讀，所有檢材仍均檢出分型，不同檢材各位點分型一致，表明構(gòu)建ddPCR體系適合多類型法醫(yī)檢材的檢測。

Fig.3 AMSI and ratio data for each SNP at different input of reference DNA 9948 in VIC channelAsterisks in each chart denote significantly different measurements compared to the 0.5 ng reference DNA 9948(**P＜0.01,***P＜0.001).

Fig.4 AMSI data for each SNP of sample SY in VIC channelSwab 1 presents bottle mouth swab; Swab 2 presents mobile phone screen swab; asterisks in each chart denote significantly different measurements compared to blood cards(*P＜0.05,**P＜0.01).

2.2.5 抗抑制能力

基于SNaPshot 和ddPCR 技術(shù)分析3 種常見抑制劑對9948 標準品DNA 檢測的干擾情況。SNaPshot 檢驗中，僅rs55981512 位點，在加入150 μg/L腐植酸時，檢出1次有效峰型；其他濃度抑制劑檢測時，所有位點均未檢測信號峰（附件圖S1）。ddPCR 檢測結(jié)果如圖5 所示，加入血紅素（350～1 400 μmol/L）、腐植酸（150～300 μg/L）和靛藍（150～300 mmol/L）時，隨著抑制劑濃度不斷增加，個別位點檢測信號與不含抑制劑比較可能出現(xiàn)波動或降低，但各位點陰陽性微滴仍能進行明顯區(qū)分；對圖6數(shù)據(jù)分析表明，添加與不添加抑制劑的9948標準品DNA的ddPCR檢測中，個別位點由于抑制劑濃度升高，雖然生成總微滴數(shù)有下降可能，但陽性微滴數(shù)目變化無顯著差異（P＞0.05），表明模板擴增未受抑制劑干擾。所以ddPCR 體系對抑制劑具有較強的耐受性。

Fig.5 Mean fluorescence signal of the positive and negative droplets in VIC channel for reference DNA 9948 spiked with serial dilutions of the inhibitors for ddPCR detectionNIC presents detecting reference DNA 9948 with no inhibitors control.

Fig.6 The number of positive droplets in VIC channel and total droplets for reference DNA 9948 spiked with serial dilutions of the inhibitors for ddPCR detectionNIC presents detecting reference DNA 9948 with no inhibitors control;asterisks in each chart denote significantly different measurements compared to no inhibition control(*P＜0.05,**P＜0.01).

2.2.6 樣本測試

表6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示：5?SNP 單倍型AGGAA 在42 份高海拔地區(qū)樣本中頻率為75%，在28 份低海拔地區(qū)頻率僅為1.8%；單倍型GAAGG 在高海拔地區(qū)頻率為25%，在低海拔地區(qū)頻率為98.2%。所以，EPAS1 基因上的5?SNP 高原適應(yīng)單倍型AGGAA高頻分布于高海拔區(qū)域，而在低海拔地區(qū)分布頻率較低。

Table 6 Haplotype frequencies of 5-SNP in test samples

3 討 論

SNP 遺傳標記在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用于個體識別、表型特征刻畫等。迄今，可供選擇的SNP 檢測方法眾多，法醫(yī)實驗室主要檢測方法有基于CE 的SNaPshot、飛行時間質(zhì)譜（MALDI?TOF MS）和二代測序。這些方法雖然具有較高的靈敏度和檢測通量，但仍存在一定的局限性，例如實驗周期長且工作量較大，對陳舊、含抑制劑類（環(huán)境污染）樣本的檢測效果不佳。同時，檢測的設(shè)備和試劑昂貴，并需要專業(yè)人員分析，僅適宜實驗室檢測，難以滿足基層現(xiàn)場快速檢測需求。近年來，ddPCR作為一種新興檢測技術(shù)，具備快速、單分子檢測和強抗干擾能力，在痕量和混雜背景樣本檢測中展現(xiàn)了極大的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、植物和病毒等領(lǐng)域［21?23］，但目前其在法醫(yī)學(xué)研究少［24?25］。因此，本研究在國產(chǎn)ddPCR 平臺構(gòu)建了5?SNP 分型檢測體系，并對其性能測試結(jié)果進行初步探討。

本研究中，ddPCR 在SNP 分型檢測的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：a.實驗操作簡便，檢測速度快。僅需3個步驟，微滴生成（5 min）、PCR擴增（＜2 h）和熒光信號檢測（25 min），在2.5 h內(nèi)即可獲取檢測結(jié)果。相比如CE、質(zhì)譜和二代測序平臺，檢測效率明顯提高。b. 體系構(gòu)建便捷，結(jié)果易判讀。ddPCR 主要依據(jù)微滴熒光信號強度、數(shù)目及熒光類型進行SNP 判型，無需涉及繁瑣的體系優(yōu)化調(diào)試；同時在構(gòu)建體系時設(shè)計了較短的PCR 產(chǎn)物（＜150 bp），可提高體系對降解檢材的檢測能力。c. 抗抑制能力突出。在較高濃度抑制劑檢測時，ddPCR 可弱化抑制劑對PCR 擴增效率的影響，保證檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。本研究實驗結(jié)果表明，5?SNP 分型檢測體系重復(fù)性好、結(jié)果準確可靠，最低檢測限0.312 5 ng基因組DNA，符合法醫(yī)現(xiàn)場檢測要求［19］。

當前，含抑制劑類樣本檢測仍舊是法醫(yī)實踐應(yīng)用中的一大難點。盡管通過純化可以去除部分抑制劑，但其易損耗樣本DNA（回收率10%～80%）并增加污染的風(fēng)險，因此不適用微量樣本分析［26］。目前，法醫(yī)實驗室主流的SNaPshot 和質(zhì)譜檢測對樣本純度要求較高，其中在SNaPshot 檢測中，隨著抑制劑含量增加，位點檢測峰值降低，并伴有異?；螂s峰出現(xiàn)，易干擾位點判型［27?28］。質(zhì)譜檢測對樣本質(zhì)和量要求更高（＞10 ng），因而極少應(yīng)用于現(xiàn)場樣本檢測［19］。二代測序在法醫(yī)實際工作中，對DNA的質(zhì)和量要求較高［29］，抗抑制劑能力也在一定程度上限制其發(fā)展，商用法醫(yī)試劑盒（Illumina Beta?Version ForenSeqTMDNA Signature Prep Kit）在MiSeq FGx 法醫(yī)專用測序儀檢測時，200 mg/L 腐植酸或800 μmol/L 血紅素會導(dǎo)致體系擴增完全抑制［30］。同時，在法醫(yī)學(xué)常規(guī)檢測應(yīng)用中，也需考慮該平臺與檢材類型（如血液和土壤類樣本）的適用性［31］。

ddPCR“微滴式”技術(shù)不易受抑制劑干擾［32?34］。本研究測試了法醫(yī)學(xué)檢材中3類常見的抑制劑：血紅素、腐植酸和靛藍，結(jié)果顯示ddPCR相比SNaPshot 檢測對抑制物展現(xiàn)更高的耐受性。但值得注意的是，實驗中使用的血紅素、腐植酸和靛藍均較難溶于水，隨著抑制物含量增多，難溶性顆粒物可能會堵塞微滴生成芯片上的微流控通道造成微滴生成失敗或微滴破裂［35］。因此雖然ddPCR抗抑制能力強，仍建議樣本處理時按照常規(guī)DNA提取純化步驟進行操作，以降低顆粒物濃度。

此外，在ddPCR檢測中設(shè)立空白對照很重要，ddPCR 依據(jù)微滴終點熒光信號強度差異，進行陰陽性微滴判定，所以空白對照是陰陽性閾值線設(shè)定的重要依據(jù)，并可監(jiān)測體系有無污染情況［36］。盡管不同類型檢材個別位點檢測信號可能存在差異，尤其是在分析DNA 純度較差樣本時檢測信號有降低趨勢，但這種信號差異并不會影響微滴陰陽性狀態(tài)判斷，仍可正確獲取分型。因此，ddPCR 技術(shù)這一優(yōu)勢為法醫(yī)學(xué)陳舊、降解或含抑制劑類（環(huán)境污染）等疑難檢材的檢測提供潛在的應(yīng)用價值。但是目前（表7），ddPCR 相比法醫(yī)常用檢測技術(shù)，仍存在一定的局限性，即檢測通量低，在較多位點檢測時，靈敏度也將有所降低。因此，在實際應(yīng)用中位點檢測數(shù)量是該方法需結(jié)合考慮的要點。

Table 7 Characteristics of commonly forensic used methods for SNP genotyping

4 結(jié) 論

基于ddPCR 的SNP 檢測體系具有準確可靠、簡便快速、抗抑制能力強等優(yōu)勢，適合法醫(yī)現(xiàn)場生物檢材檢測。此外，本研究使用的檢測儀器、耗材和試劑均為國產(chǎn)，檢測成本低、數(shù)據(jù)安全性高，易于在法醫(yī)實驗室普及。下一步我們將繼續(xù)探索構(gòu)建多色熒光通道ddPCR 檢測體系，提高SNP 位點單管檢測數(shù)量，并探索其在RNA、DNA 甲基化等遺傳標記檢測方面的潛力。

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