朱夢(mèng)鑫，劉 茗，張 建，王 宇，武彥芳，霍星孜

（宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000）

藥用蒲公英（Taraxacum officinalis）為菊科蒲公英屬植物，分布廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，具有多糖、多酚、三萜[1，2]等活性成分，在藥劑、食品、化妝品、飼料等方面具有廣泛應(yīng)用.隨著需求量越來(lái)越大，蒲公英栽培面積逐漸增大. 對(duì)蒲公英種子萌發(fā)特性[3]、栽培技術(shù)[4]、抗病性[5]等雖有相關(guān)研究，但藥用蒲公英依然存在抗病性低、藥用成分含量低、產(chǎn)量低等問(wèn)題. 多倍體育種對(duì)于提高植物抗性、產(chǎn)量以及有效成分含量具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì).誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥劑主要是秋水仙素，用于處理萌發(fā)的種子、嫩芽、愈傷組織等[6，7]，以獲得多倍體植株，這在燕麥[8]、人參果[9]、獼猴桃[10]等植物方面獲得了成功. 本文將藥用蒲公英種子用不同濃度秋水仙素處理，旨在篩選出最佳的染色體加倍條件，并對(duì)秋水仙素處理過(guò)的蒲公英幼苗進(jìn)行移栽，以獲得有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的蒲公英材料.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥用蒲公英種子為2020年5月收集，4℃冰箱保存，千粒重為（0.043±0.0021）g.五個(gè)月后進(jìn)行秋水仙素處理.

1.2 試驗(yàn)方法

（1）秋水仙素處理. 避光條件下稱(chēng)取秋水仙素粉末，配置0.1%、0.3%、0.5%濃度的秋水仙素溶液，4℃下依次浸泡處理1d、3d、5d，蒸餾水浸泡作對(duì)照，共12 組處理，每個(gè)處理100 粒種子，重復(fù)三次.將秋水仙素處理后的種子用清水徹底清洗，分別放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，定期澆水使濾紙始終保持濕潤(rùn)狀態(tài).在生態(tài)培養(yǎng)箱中進(jìn)行25℃黑暗條件培養(yǎng).觀察并記錄種子每日發(fā)芽數(shù)，計(jì)算最終發(fā)芽率.同時(shí)觀察并記錄種苗的形態(tài)特征，并與對(duì)照組做比較分析.培養(yǎng)至第10 天，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量萌發(fā)種子的胚根、胚軸和胚芽長(zhǎng)度，每個(gè)處理中隨機(jī)選取10棵蒲公英幼苗，進(jìn)行相關(guān)測(cè)定.

（2）移栽管理. 每一組不同濃度秋水仙素處理的種子培養(yǎng)的第20 天，分別將種苗移栽進(jìn)裝有椰土的花盆中，正常管理，每一盆標(biāo)記上組數(shù)和濃度便于后期統(tǒng)計(jì)觀察，放入培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)，定期澆水.三組種苗移栽的操作步驟相同.

（3）根系構(gòu)型觀察. 對(duì)移栽培養(yǎng)2 個(gè)月后成活的幼苗使用根系掃描儀MICROTK SANMAKER i800plus測(cè)量蒲公英種根的長(zhǎng)度、面積、平均直徑.

（4）氣孔密度觀察. 對(duì)移栽成活四個(gè)月的蒲公英撕取下表皮制作裝片使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，與對(duì)照比較進(jìn)行分析.

（5）計(jì)算分析. 參照武彥芳[11]的方法對(duì)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)進(jìn)行計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對(duì)藥用蒲公英種子萌發(fā)的影響

從表1 中可看出清水處理的對(duì)照組發(fā)芽率最高，0.5%秋水仙素處理的對(duì)種子發(fā)芽率最低，總體呈現(xiàn)出發(fā)芽率與處理濃度成反比的關(guān)系.種子萌發(fā)過(guò)程中，對(duì)照組發(fā)芽率最高，秋水仙素處理的種子發(fā)芽率受到不同程度抑制，隨著處理濃度的提高，種子發(fā)芽率逐漸下降，可能是秋水仙素對(duì)種子產(chǎn)生了毒害作用，導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低.

表1 不同秋水仙素處理組合對(duì)種子萌發(fā)的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的種子萌發(fā)情況均為浸泡3 天的萌發(fā)率最高、發(fā)芽速度最快，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均高于浸泡1 天和5 天的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù).可見(jiàn)，浸泡3 天的種子吸水量最為適宜，有助于種子萌發(fā)，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)導(dǎo)致種子萌發(fā)率的降低.

2.2 不同濃度秋水仙素處理對(duì)幼苗形態(tài)的影響

萌發(fā)10 天后，每處理組合中隨機(jī)取出4 個(gè)幼苗拍照并進(jìn)行形態(tài)比較分析（圖1），再對(duì)每組進(jìn)行幼苗胚根、胚軸和子葉長(zhǎng)度測(cè)量，得到的結(jié)果見(jiàn)表2.圖1 顯示，經(jīng)秋水仙素處理的種子與清水處理的種子相比，胚軸的直徑明顯增大，且隨著秋水仙素處理濃度的提高，胚軸直徑明顯增加，胚芽和胚軸長(zhǎng)度縮短，胚根出現(xiàn)黃化腐爛現(xiàn)象. 經(jīng)秋水仙素處理后，蒲公英幼苗形態(tài)出現(xiàn)不同程度變異，出現(xiàn)三片子葉的幼苗，萌發(fā)初期，誘變劑對(duì)植物組織的正常生理環(huán)境造成破壞，導(dǎo)致形態(tài)的改變.

表2 不同秋水仙素處理組合對(duì)幼苗質(zhì)量的影響

圖1 不同濃度秋水仙素處理三天的幼苗形態(tài)

2.3 秋水仙素對(duì)蒲公英根的影響

秋水仙素處理后，對(duì)蒲公英的根生長(zhǎng)有不同作用.通過(guò)使用MICROTK SANMAKER i800plus 對(duì)處理后移栽成活的三株蒲公英根的長(zhǎng)度、表面積、平均直徑進(jìn)行測(cè)定（圖2、表3）. 實(shí)驗(yàn)組1 總根長(zhǎng)、表面積均小于對(duì)照，這可能是秋水仙素導(dǎo)致多次加倍，從而使植株表現(xiàn)矮小，發(fā)育遲緩.實(shí)驗(yàn)組2 主根長(zhǎng)度和平均直徑明顯大于對(duì)照組，總根長(zhǎng)和根表面積遠(yuǎn)小于對(duì)照組總根長(zhǎng)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組2 側(cè)根極不發(fā)達(dá).實(shí)驗(yàn)組3 根的平均表面積和平均直徑明顯大于正常組的平均根表面積和直徑，效果較好，根系發(fā)達(dá).

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蒲公英的根對(duì)比圖

表3 秋水仙素對(duì)蒲公英根的影響

2.4 氣孔密度觀察

實(shí)驗(yàn)組移栽成活四個(gè)月后，撕取下表皮，用光學(xué)顯微鏡觀察正常蒲公英和經(jīng)秋水仙素處理的蒲公英葉片下表皮氣孔的大小及氣孔數(shù)目.在10×40倍下，觀察氣孔的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)十個(gè)視野范圍內(nèi)氣孔的數(shù)量，通過(guò)在顯微鏡下觀察正常蒲公英和加倍蒲公英葉片的表皮氣孔（圖3），發(fā)現(xiàn)對(duì)照組蒲公英葉片氣孔47個(gè)左右，秋水仙素處理的蒲公英葉片氣孔每個(gè)視野27 個(gè)左右.經(jīng)處理的蒲公英葉片氣孔數(shù)明顯少于對(duì)照組的蒲公英葉片氣孔.

圖3 秋水仙素處理獲得植株和正常植株葉片氣孔

3 結(jié)論與討論

3.1 秋水仙素對(duì)蒲公英種子萌發(fā)的影響

秋水仙素對(duì)蒲公英種子萌發(fā)率呈現(xiàn)出處理濃度與種子萌發(fā)率成反比的關(guān)系，且第三天浸泡處理種子的萌發(fā)率最高.隨著秋水仙素處理濃度的提高，藥用蒲公英種子的發(fā)芽率明顯下降，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[12]，可能是因?yàn)榍锼伤乇旧淼亩拘詫?duì)蒲公英種子產(chǎn)生了毒害作用，抑制種子的萌發(fā)，導(dǎo)致發(fā)芽率的降低.在處理濃度相同時(shí)，三天浸泡處理的萌發(fā)率均為最高，猜測(cè)是因?yàn)榻萑斓钠压⒎N子吸水達(dá)到一個(gè)適宜狀態(tài)，種子生理活性較強(qiáng)，有利于種子的萌發(fā). 徐佳琦等[13]在秋水仙素對(duì)洋紫荊種子處理的實(shí)驗(yàn)中表明：在秋水仙素處理濃度相同時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，其發(fā)芽率也呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，處理24h 的發(fā)芽率顯著大于其他處理時(shí)間，二者趨勢(shì)相同，但最佳浸泡時(shí)間存在差異，這說(shuō)明適宜的浸泡處理時(shí)間有利于種子的萌發(fā)，但不同植物種類(lèi)的種子，其適宜浸泡處理時(shí)間不同.

3.2 秋水仙素對(duì)蒲公英幼苗的影響

秋水仙素處理對(duì)蒲公英幼苗影響主要體現(xiàn)在胚軸增粗縮短、子葉明顯增厚.方慶[14]在對(duì)石榴種子的研究中表明石榴種子在經(jīng)秋水仙素處理后，其幼苗冠幅大多比未經(jīng)處理的幼苗冠幅大. 梁海峰等[15]在對(duì)紅肉火龍果種子的研究中也提出經(jīng)秋水仙素處理后的幼苗與對(duì)照相比出現(xiàn)一些形態(tài)上的變異，表現(xiàn)為幼苗矮化、生長(zhǎng)緩慢、子葉肥厚、胚軸膨大，說(shuō)明秋水仙素對(duì)不同幼苗的影響不同，具有個(gè)體差異.本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)秋水仙素處理對(duì)胚根影響較大，具有毒害作用[6]，經(jīng)處理過(guò)的胚根易發(fā)黑損壞，導(dǎo)致胚軸部難以生長(zhǎng)出新胚根，從而導(dǎo)致幼苗營(yíng)養(yǎng)耗盡后死亡，這也是導(dǎo)致后期蒲公英存活率低的主要原因；但秋水仙素對(duì)蒲公英種子胚軸和子葉的誘導(dǎo)效果較好，其胚軸明顯縮短，子葉明顯增厚，可能是染色體加倍產(chǎn)生了變異，但這種胚根損壞的幼苗不能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，難以形成正常的根系. 因此，對(duì)秋水仙素處理的蒲公英種子，應(yīng)采取激素誘導(dǎo)或者組織培養(yǎng)的方式，可獲得大量可供利用的誘導(dǎo)材料，為進(jìn)一步選育提供材料基礎(chǔ).

3.3 秋水仙素誘導(dǎo)對(duì)植株的影響

秋水仙素誘導(dǎo)對(duì)蒲公英的影響是不同的.通過(guò)對(duì)存活三株的蒲公英進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，地上部分三株蒲公英在形態(tài)上均存在葉片增厚的現(xiàn)象，這與基因劑量效應(yīng)使多倍體細(xì)胞體積、植物器官增大，使之表現(xiàn)出巨大性有關(guān)[16，17]；在氣孔特征上出現(xiàn)單位面積內(nèi)氣孔數(shù)減少，氣孔增大的情況，這一結(jié)果與前人研究一致[18]，根據(jù)其葉片增厚和氣孔的變化，可初步認(rèn)定這三株蒲公英均為加倍植株.其中一株較正常植株根系更加發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)更加旺盛，猜測(cè)可能成功加倍，達(dá)到最佳倍性，從而使植株表現(xiàn)優(yōu)良；另外兩株根系體積較正常明顯縮小，葉片產(chǎn)生卷曲，有可能發(fā)生倍性混雜，從而使植株表現(xiàn)弱小，生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，說(shuō)明秋水仙素對(duì)蒲公英倍性可能會(huì)有產(chǎn)生不同的效果，這方面還需要結(jié)合流式細(xì)胞儀以及染色體觀察，確定其倍性，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)生物學(xué)基礎(chǔ).