楊慶鐸，趙錦程，朱曉峰

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

AD多發(fā)生于老年及老年前期，其主要病理改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍壮练e形成的細(xì)胞外老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生。發(fā)病的主要特征有進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙等。臨床表現(xiàn)為記憶障礙、失語(yǔ)、失用、抽象思維、人格以及行為改變等。AD的發(fā)病機(jī)制與衰老密切相關(guān)。目前主要有Aβ假說(shuō)、tau蛋白假說(shuō)、炎癥假說(shuō)和神經(jīng)保護(hù)假說(shuō)等。Aβ被認(rèn)為是各種原因誘發(fā)阿爾茨海默病的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵性因素[1]，其大量聚集的現(xiàn)象，被認(rèn)為是對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的突觸、線粒體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷的元兇之一，且Aβ大量沉積亦被認(rèn)為是AD的經(jīng)典病例特征之一[2]。中藥遠(yuǎn)志，是我國(guó)重要的常用中草藥之一，具備安神醒腦、祛痰、消腫的功效，被視作“養(yǎng)命要藥”[3]，多用于治療心腎不交引起的失眠多夢(mèng)、健忘驚悸、神志恍惚等癥狀。SEN為遠(yuǎn)志主要皂苷類(lèi)化合物之一。研究表明，遠(yuǎn)志皂苷具備鎮(zhèn)靜催眠、改善學(xué)習(xí)記憶、抑菌抗炎、抗抑郁、抗衰老以及保護(hù)心腦血管等多種生物活性[4，5]。

因此，本項(xiàng)目旨在采用PC12細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，經(jīng)Aβ25-35致傷建立AD體外模型，探討SEN對(duì)AD的影響。通過(guò)檢測(cè)SEN對(duì)Aβ25-35致傷PC12神經(jīng)元樣細(xì)胞可以反映突觸可塑性的三種相關(guān)蛋白PSD-95、Syn、ERK1/2的mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討SEN干預(yù)AD的可能機(jī)制，為阿爾茨海默病的治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

遠(yuǎn)志皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京Solarbio公司；PC12細(xì)胞購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物公司；Aβ25-35寡聚體購(gòu)自北京Bioss公司；腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自武漢ProSpec-Tany公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自北京孚博生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用含有濃度50ng/mL的NGF的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4～5d后，使PC12細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。將分化后的PC12神經(jīng)元樣細(xì)胞接種到含Aβ25-35寡聚體濃度為10μmol/L的1640完全培養(yǎng)基的六孔板中，致傷細(xì)胞48h，建立AD模型，分別設(shè)為模型組(B組)、BDNF對(duì)照組(C組)、SEN低劑量組(D組)、SEN高劑量組(E組)。

空白對(duì)照組(A組)加入生理鹽水的完全培養(yǎng)液；模型組(B組)處置同A組；BDNF對(duì)照組(C組)加入含BDNF濃度50ng/mL的完全培養(yǎng)液；SEN低劑量組(D組)加入含濃度25μmol/L SEN的完全培養(yǎng)液；SEN高劑量組(E組)：加入含濃度50μmol/L SEN的完全培養(yǎng)液。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率

10μmol/L的Aβ25-35寡聚體作用48h后，A組(空白對(duì)照組)、B組(模型組)、C組(BDNF對(duì)照組)、D組(SEN低劑量組)和E組(SEN高劑量組)OD值分別為0.394±0.062、0.188±0.024、0.333±0.052、0.232±0.035和 0.282±0.036。模型組的細(xì)胞存活率明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)。同時(shí)，SEN低劑量組、SEN高劑量組的細(xì)胞存活率要明顯的高于模型組(P<0.05，P<0.01)。BDNF對(duì)照組、SEN低劑量組、SEN高劑量組各組間比較，細(xì)胞存活率差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

模型組細(xì)胞PSD-95mRNA、SynmRNA及ERK1/2mRNA的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，BDNF對(duì)照組、SEN低劑量組及SEN高劑量組PSD-95mRNA、SynmRNA、ERK1/2mRNA的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，且SEN高劑量組PSD-95mRNA、SynmRNA、P-ERK1/2mRNA的表達(dá)明顯高于SEN低劑量組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

模型組細(xì)胞PSD-95、Syn及P-ERK1/2的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，BDNF對(duì)照組、SEN低劑量組及SEN高劑量組PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，且SEN高劑量組PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表達(dá)明顯高于SEN低劑量組(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 PSD-95、Syn及ERK1/2mRNA及蛋白表達(dá)情況

圖1 3種蛋白Western blot檢測(cè)

3 討論

突觸可塑性與PSD-95密切相關(guān)，具有接受、整合突觸信號(hào)并將其傳導(dǎo)給突觸后細(xì)胞的功能分子裝置，在突觸可塑性中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，輕度認(rèn)知功能損傷患者的海馬PSD-95水平明顯下調(diào)[6]；AD模型大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95表達(dá)明顯下調(diào)。提示PSD-95表達(dá)異?？赡芘cAD的發(fā)病有關(guān)[7,8]，PSD-95表達(dá)水平與AD早期認(rèn)知功能改變有關(guān)。

突觸素(Syn)是分布在突觸前囊泡膜上的鈣結(jié)合酸性糖蛋白， Syn的分布和密度可間接的反映突觸的數(shù)量和傳遞效能[9]。通過(guò)影響突觸結(jié)構(gòu)以及磷酸化作用，調(diào)控乙酰膽堿、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。Syn對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)表明其與腦功能活動(dòng)關(guān)系密切。AD模型大鼠海馬區(qū)Syn表達(dá)減少。同時(shí)，突觸密度下降，神經(jīng)元突觸的聯(lián)系減少，導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元遞質(zhì)釋放減少，學(xué)習(xí)記憶能力減退。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的一員[10]。ERK可活化海馬CA1區(qū)NMDA受體非依賴(lài)型LTP，部分皮層神經(jīng)通路的LTP等亦需要ERK的活化[11]，表明ERK可參與多種形式的突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞PSD-95mRNA、SynmRNA及ERK1/2mRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，BDNF對(duì)照組、SEN低劑量組及SEN高劑量組PSD-95mRNA、SynmRNA、ERK1/2mRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，且SEN高劑量組PSD-95mRNA、SynmRNA、P-ERK1/2mRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯高于SEN低劑量組。證明以濃度為10μmol/L的Aβ25-35作用于細(xì)胞48h后，PC12神經(jīng)元樣細(xì)胞受到明顯損傷，SEN能對(duì)Aβ25-35致傷PC12神經(jīng)元樣細(xì)胞產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用，顯著改善其突觸可塑性，且SEN高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。SEN對(duì)抗Aβ25-35損傷的機(jī)制可能與影響突觸可塑性功能蛋白PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制尚需后續(xù)深入研究論證。