寇永杰 ,李 瑞 ,鄭亞?wèn)| ,夏天奇 ,時(shí)恒枝 ,王 璞 ,楊 興,孫曉林

多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)在自然條件下主要寄生在終末宿主狐貍體內(nèi),其幼蟲多房棘球蚴則寄生在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)。在少數(shù)情況下,人因食用了被蟲卵污染的食物或水也可以感染,引起多房棘球蚴病,又稱泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)。AE在我國(guó)西北牧區(qū)是一種比較常見的寄生蟲病,傳播范圍廣,致病力強(qiáng),嚴(yán)重危害牧民的生命健康[1]。在寄生過(guò)程中,多房棘球蚴不僅對(duì)肝臟造成機(jī)械性損傷,也能引起肝臟腫大和膿腫,進(jìn)而誘發(fā)肝癌。由于AE 潛伏期較長(zhǎng),達(dá)5～10年之久,且缺乏有效的早期檢測(cè)方法和有效的治療手段,使得該病在我國(guó)現(xiàn)階段仍有一定的流行,難以根除[2]。

隨著對(duì)RNA 分子研究的深入,一類特異結(jié)合RNA 分子的蛋白質(zhì),即RNA 結(jié)合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)被發(fā)現(xiàn),它們?cè)诙喾考蚪{蟲的生命活動(dòng)和寄生蟲-宿主互作中發(fā)揮重要作用。RBPs是一類與RNA 結(jié)合并參與RNA 合成、翻譯、剪切和代謝的蛋白質(zhì)[3]。除了少部分非編碼RNA是以核酶的形式存在并發(fā)揮作用外,大部分則需要與RBPs結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物而發(fā)揮作用[4]。RBPs的種類有很多,約占細(xì)胞總蛋白的6%～8%,但目前只有為數(shù)不多的RBPs的生物學(xué)功能較為清楚,例如Argonautes蛋白(AGO)、Human antigen R 蛋白(HuR)、RNA 結(jié)合 蛋 白Tristetraprolin(TTP)等。這些蛋白主要與RNA 分子發(fā)生互作,負(fù)責(zé)調(diào)控甲基化修飾、miRNAs沉默復(fù)合體的形成、可變剪切等生物學(xué)過(guò)程[5-7]。RBPs作為一種多功能調(diào)節(jié)因子,其修飾及空間構(gòu)象的改變也可影響與RNA 結(jié)合的穩(wěn)定性,從而引起細(xì)胞一系列生物學(xué)功能的改變,這些變化往往會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[8-9]。事實(shí)證明,RBPs對(duì)RNA 的調(diào)控作用,還受到一些與RBPs互作的效應(yīng)蛋白影響。但到目前為止,對(duì)多房棘球絳蟲RBPs及其互作蛋白質(zhì)的研究鮮有報(bào)道[10]。

本研究通對(duì)多房棘球絳蟲RNA 結(jié)合蛋白編碼基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)RNA binding proteins 28(EmuJ_001107900.1,RBP28)是一種在多房棘球絳蟲中表達(dá)的RBPs。通過(guò)制備特異性較高的多克隆抗體,探究了RBP28蛋白在蟲體及其細(xì)胞內(nèi)的分布情況。同時(shí)利用免疫共沉淀和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù),初步篩選了潛在與RBP28互作的蛋白質(zhì)。這有助于進(jìn)一步解析RBP28與其蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系及其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用的多房棘球蚴為實(shí)驗(yàn)室保存;新西蘭大白兔SCXK(甘)2020-0002購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a、BL21(DE)感受態(tài)細(xì)胞均為實(shí)驗(yàn)室保存;TRIzol LS Reagent購(gòu)自美國(guó)Ambion公司;IPTG、細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑購(gòu)自ThermoFisher公司;HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司;免疫共沉淀試劑購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.3 多房棘球蚴總RNA 和總蛋白的提取 按照RNA 提取試劑的操作步驟,提取多房棘球蚴總RNA,并測(cè)定RNA 濃度。蟲體總蛋白的提取方法如下:將混有蛋白酶抑制劑的IP 裂解液(1∶100)500μL 與蟲體混勻,進(jìn)行研磨破碎;隨后于4 ℃,13 000×g離心20 min,收集上清,測(cè)定蛋白濃度。

1.4 RBP28編碼基因的擴(kuò)增、原核表達(dá)及重組蛋白的純化 按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中RBP28基因序列設(shè)計(jì)帶有BamH I和SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物,上游引物為:5′-GGATCCATGGGGCGGAGGTCAGGG-3′;下游引物為:5′-GAGCTCTTACTTTCCTTTCTTCGG3′-(下標(biāo)序列為酶切位點(diǎn)序列),PCR 反應(yīng)體系:96 ℃變性3 min;95℃30 s,57℃40 s,72℃90s,36個(gè)循環(huán);72℃10 min。將目的產(chǎn)物連接至p ET-28a質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入BL21菌株,加入IPTG 進(jìn)行16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。超聲破碎后,用Ni-NTA 柱進(jìn)行蛋白純化,8% SDSPAGE檢測(cè)目的蛋白純度。

1.5 RBP28多克隆抗體的制備及Western blot分析 免疫新西蘭大白兔,進(jìn)行3次免疫接種,每次接種間隔為15 d。45 d后,收集兔血清,用飽和硫酸氨法純化抗體。利用純化抗體對(duì)多房棘球蚴全蟲蛋白和重組蛋白R(shí)BP28進(jìn)行Western blotting檢測(cè),將蛋白變性后經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳分離,將制備的抗體作為一抗,以HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 作為二抗,進(jìn)行蛋白鑒定。

1.6 免疫熒光定位 將制備好的多房棘球蚴包囊切片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)。PBS清洗后,加0.25%Triton X-100處理15 min,之后加入RBP28多克隆抗體(1∶200)作為一抗,再加AlexaFluor 594標(biāo)記的山羊抗家兔IgG(1∶2 000),暗盒中37 ℃孵育1 h。滴加DAPI染液,在鏡下觀察。將多房棘球蚴剪碎后,加入含有胰酶的PBS溶液,37 ℃,消化1 h。將消化后的蟲體細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞貼壁后,棄上清,加入1 mL 4%多聚甲醛,固定30 min,其他步驟同上。同時(shí),設(shè)陰性血清作為對(duì)照。

1.7 免疫共沉淀與蛋白銀染 免疫共沉淀步驟參照PierceTMCo-Immunoprecipitation Kit操作說(shuō)明書進(jìn)行。分別設(shè)置陰性血清組(G－)和多克隆抗體組(G＋)。對(duì)免疫共沉淀產(chǎn)物樣品在經(jīng)10%SDSPAGE電泳后,通過(guò)銀染進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 質(zhì)譜分析 將陰性血清組G－和多克隆抗體組G＋的產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司。使用Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析,獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)ProteinPilot(V4.5)進(jìn)行檢索。對(duì)Uniprot(https://www.uniprot.org)和

Worm Base(https://parasite.wormbase.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索時(shí),采用Paragon算法,檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 RBP28基因克隆和p ET-28a-RBP28重組質(zhì)粒的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及純化 經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增得到與RBP28編碼基因大小相同的單一條帶,大小為1 245 bp(圖1A),且p ET-28a-RBP28質(zhì)粒成功構(gòu)建(圖1B)。SDS-PAGE 結(jié)果顯示,重組蛋白在上清中的表達(dá)量較高,相對(duì)分子質(zhì)量約為Mr50 000。在純化過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)以300 mmol/L咪唑進(jìn)行洗脫時(shí),純化效果較好(圖1C)。

圖1 RBP28基因擴(kuò)增及其誘導(dǎo)表達(dá)、純化Fig.1 Amplification,induced expression and purification of the RBP28 gene

2.2 RBP28多克隆抗體制備及特異性檢測(cè) 采集血清制備RBP28 多克隆抗體,SDS-PAGE 結(jié)果可見重鏈和輕鏈(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示,無(wú)論是純化的重組蛋白R(shí)BP28還是多房棘球蚴全蛋白約在相對(duì)分子質(zhì)量Mr50 000處均出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶,而陰性對(duì)照則沒(méi)有,表明制備的RBP28重組蛋白抗體具有較好的特異性,如圖2B 和2C 所示。在細(xì)粒棘球絳蟲中能夠檢測(cè)到很淡的反應(yīng)條帶,但是條帶位置與RBP28不同,然而在豬帶絳蟲和泡狀帶絳蟲中卻沒(méi)檢測(cè)到明顯的反應(yīng)條帶(圖2D),提示RBP28是一種多房棘球絳蟲階段特異表達(dá)的RNA 結(jié)合蛋白。

圖2 RBP28重組蛋白抗體制備及特異性檢測(cè)Fig.2 Preparation and specificity detection of RBP28 recombinant protein antibodies

2.3 RBP28在多房棘球蚴及其細(xì)胞中的分布 對(duì)多房棘球蚴組織切片熒光染色發(fā)現(xiàn),RBP28蛋白主要分布在生發(fā)層(圖3A),而在多房棘球蚴細(xì)胞,它則主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖3B),提示它可能在寄生蟲生長(zhǎng)、發(fā)育中發(fā)揮作用。

圖3 RBP28在多房棘球蚴包囊和細(xì)胞中的分布Fig.3 Distribution of RBP28 in E.multilocularis cysts and cells

2.4 免疫共沉淀產(chǎn)物銀染及質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析 SDS-PAGE 銀染顯示,RBP28多克隆抗體組(G＋)免疫共沉淀產(chǎn)物,與陰性血清組(G－)的相比,條帶分布有所不同,特別是在相對(duì)分子質(zhì)量Mr70 000～90 000(圖4),可能存在RBP28的互作蛋白。

圖4 免疫共沉淀產(chǎn)物銀染Fig.4 Silver staining of immunoprecipitation products

質(zhì)譜結(jié)果為G－組共獲得蛋白215種,而G＋組獲得蛋白161種。對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行韋恩圖分析,發(fā)現(xiàn)有24種蛋白是G＋組所特有的(圖5)。隨后通過(guò)基因序列及功能比對(duì)分析,初步篩選出了7個(gè)最有可能與RBP28相互作用的蟲體蛋白,包括核糖體產(chǎn)生因子2 同源蛋白(ribosome production factor 2 homolog)、糖蛋白抗原5(glycoprotein antigen 5)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy kinase)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、14-3-3 蛋白同源物2(14-3-3 protein homolog 2),以及2個(gè)未知的保守蛋白,即蛋白Anoctamin 和Expressed conserved protein(表1)。

表1 可能與RBP28互作的蛋白質(zhì)Tab.1 Potential proteins in interaction with RBP28

圖5 免疫共沉淀產(chǎn)物ESI質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果韋恩圖Fig.5 Venn diagram of ESI mass spectrometry results for immunoprecipitation products

3 討論

多房棘球絳蟲屬于圓葉目、帶科、棘球?qū)?人和易感動(dòng)物因誤食蟲卵污染的食物而感染該寄生蟲。蟲卵進(jìn)入到腸胃,激活后突破胃腸道壁進(jìn)入血液循環(huán),最終定植于寄生部位發(fā)育。由于多房棘球蚴特殊的寄生方式,目前對(duì)多房棘球蚴的體內(nèi)發(fā)育機(jī)制仍不清楚[11]。在生物基因的表達(dá)中,RBPs發(fā)揮著重要的作用。因此,對(duì)于多房棘球絳蟲RBPs的研究有助于了解其生長(zhǎng)發(fā)育。在一些物種和疾病中RBPs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)起到重要的作用,例如研究表明胰島素樣生長(zhǎng)因子2 m RNA 結(jié)合蛋白家族、Mex-3家族蛋白和Musashi2(MSI2)蛋白家族等一些RBPs與物質(zhì)代謝、癌癥和腫瘤等有著密切的聯(lián)系[12-14]。此外,RBPs在寄生蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中也發(fā)揮作用。研究表明,布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)RBP10(RNA binding protein 10)在促進(jìn)布氏錐蟲的形態(tài)分化的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[15]。本實(shí)驗(yàn)中,我們選擇多房棘球絳蟲RBP28作為研究對(duì)象,通過(guò)原核表達(dá)、純化、制備特異性多克隆抗體等證實(shí),制備的RBP28多克隆抗體能夠識(shí)別多房棘球蚴全蟲蛋白中的天然RBP28,與泡狀帶絳蟲和豬帶絳蟲全蟲蛋白不反應(yīng),只與細(xì)粒棘球絳蟲全蟲蛋白有著微弱的反應(yīng),并且反應(yīng)條帶位置不同,表明RBP28可是一種多房棘球絳蟲幼蟲階段特異表達(dá)的RNA 結(jié)合蛋白。

目前大部分研究集中于分析RBPs與RNA 分子之間的相互關(guān)系,以了解RBPs如何調(diào)控RNA分子,以及這種調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)的作用。一些研究發(fā)現(xiàn),RBPs對(duì)特定RNA 分子調(diào)控時(shí),存在一些與RBPs類似作用或輔助作用的效應(yīng)蛋白,很大程度上參與并影響RNA 分子與RBPs之間的互作[16]。例如,人多聚嘧啶結(jié)合蛋白1(PTBP1)與lncRNA SNHG6(small nucleolar RNA host gene 6)的結(jié)合,受到PTBP1互作蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SETD7)的影響,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用來(lái)調(diào)控PTBP1 與lnc RNA SNHG6 之間的結(jié)合,進(jìn)而影響肝癌的發(fā)生[17]。為了發(fā)現(xiàn)與RBP28互作的蛋白,本研究以RBP28蛋白作為誘餌,在多房棘球蚴全蟲蛋白中篩選互作蛋白。由于多房棘球蚴蛋白質(zhì)組成復(fù)雜,而且本實(shí)驗(yàn)所使用的抗體為多克隆抗體,難免會(huì)有一些非特異性的吸附。為了確保實(shí)驗(yàn)的可靠性,我們采用對(duì)兔IgG 有較高結(jié)合能力的免疫共沉淀Protein G 磁珠,有效降低非特異性結(jié)合的影響。

在質(zhì)譜的結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)有24個(gè)蛋白是G＋組所特有的。經(jīng)過(guò)蛋白序列對(duì)比和功能預(yù)測(cè),我們共篩選出7種可能與RBP28存在互作的蛋白。其中,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和磷酸甘油醛脫氫酶是參與細(xì)胞內(nèi)糖代謝的主要蛋白酶,能夠?yàn)榧?xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)提供ATP 和供氫體NADPH。我們推測(cè)這2種酶可能為RBP28結(jié)合并調(diào)控靶標(biāo)RNA 分子的過(guò)程中提供必要的能量[18-19]。糖蛋白抗原5和14-3-3蛋白同源物2 具有信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)水解功能,可能與RBP28蛋白的生物活性有關(guān)[20-21]。核糖體合成因子2 同源蛋白屬于核糖體蛋白家族,在RNA 的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和多肽的合成方面具有重要的作用。核糖體蛋白也可以作為一種RBPs[22-23],它與RBP28的互作可能對(duì)于r RNA 的生物功能具有一定影響。RBP28與這些蛋白的互作及其生物學(xué)功能還需進(jìn)一步研究。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步探究多房棘球絳蟲RBP28與其互作蛋白的關(guān)系和分子機(jī)制提供了一定的參考。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:寇永杰,李瑞,鄭亞?wèn)|,等.多房棘球絳蟲RNA 結(jié)合蛋白28的鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):490-495.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.072