葉霖，黃虹蜜，吳瑩，楊升煜，李偲俊，羅小丹，馬美剛，吳原

隨著抗體檢測(cè)的普及，臨床上證明，自身免疫性癲癇(autoimmune epilepsy，AE)在癲癇中占相當(dāng)一部分比例，對(duì)抗癲癇藥物不敏感的患者，免疫療法可能有效，說明這種癲癇與自身免疫性疾病相關(guān)。2017年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)對(duì)AE的定義是:它直接由一種免疫性疾病引起，并且癲癇發(fā)作是這種疾病的核心癥狀。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體抗體是AE最常見的神經(jīng)特異性抗體之一，所致癲癇發(fā)作的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，癲癇發(fā)作的預(yù)后與患者免疫反應(yīng)進(jìn)程存在密切聯(lián)系。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，在發(fā)育期和成年期的神經(jīng)回路的發(fā)展和維護(hù)中與神經(jīng)元形成、存活及吞噬有著密切的關(guān)系。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，在癲癇的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激活可分為2種相反的類型：M1型和M2型。根據(jù)激活的表型，小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性或神經(jīng)保護(hù)作用。但對(duì)癲癇和(或)癲癇發(fā)作過程中的這種小膠質(zhì)細(xì)胞的研究不多。本研究參照文獻(xiàn)[7]的造模方法，以NMDA受體抗體介導(dǎo)的AE小鼠為研究對(duì)象，觀察癲癇發(fā)作情況并探索M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

選取健康清潔級(jí)成年雄性C57BL/6J小鼠共17只，8周齡，體質(zhì)量約18～22 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(21±1)°C，濕度(55±10)%，周圍光線明暗周期為12 h交替進(jìn)行(光期：晚上7點(diǎn)到早上7點(diǎn))，食物和水源供應(yīng)充足。C57BL/6J小鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過程均按動(dòng)物研究倫理學(xué)要求進(jìn)行。

1.2 主要儀器及試劑

合成肽GluN1359-378(購(gòu)于卓一生物);結(jié)核分枝桿菌H37Ra(購(gòu)于BDDS);完全弗氏佐劑(購(gòu)于Sigma Aldrich Laboratory);小鼠TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(購(gòu)于Boster Biological Technology)；兔抗鼠IBA-1單克隆抗體(購(gòu)于Sigma Aldrich Laboratory); 兔抗鼠Arg1單克隆抗體(購(gòu)于Boster Biological Technology); 兔抗INOS單克隆抗體(購(gòu)于Boster Biological Technology); 兔抗鼠p-p38單克隆抗體(購(gòu)于Boster Biological Technology); 兔抗鼠GADPH單克隆抗體(購(gòu)于Sigma Aldrich Laboratory)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組

小鼠隨機(jī)分為2組：抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇組(11只，模型組);正常對(duì)照組(6只)。模型組8周齡雄性C57BL/6J小鼠皮下注射200 μg多肽GluN1359-378(溶于100 μL PBS溶液)與含有600 μg結(jié)核分枝桿菌H37Ra的完全弗氏佐劑乳劑混合物，體積比1∶1，該乳劑分4次注射到四肢，每次50 μL,誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答。所有模型組小鼠在免疫時(shí)和免疫后48 h，腹腔注射含有200 ng百日咳桿菌毒素的200 μL生理鹽水。免疫2周后，模型組小鼠腹腔注射戊四氮(PTZ)50 mg/kg。對(duì)照組用同等劑量生理鹽水代替乳劑、百日咳桿菌毒素和PTZ。

1.3.2 動(dòng)物行為學(xué)觀察

觀察記錄小鼠體質(zhì)量及癇性發(fā)作情況。根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0 級(jí)為無驚厥；Ⅰ級(jí)為面部陣攣；Ⅱ級(jí)為面部陣攣+節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)為面部陣攣+節(jié)律性點(diǎn)頭+前肢陣攣；Ⅳ級(jí)為面部陣攣+節(jié)律性點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立；Ⅴ級(jí)為面部陣攣+節(jié)律性點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。根據(jù)Racine分級(jí)，選擇Ⅳ-Ⅴ級(jí)致癇小鼠作為癲癇模型組。

1.3.3 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化

小鼠斷頭取腦，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋，切片(片厚4 μm)，二甲苯透明、酒精脫水，Nissl染色液37 ℃染色30 min,水洗，風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.4 海馬組織中TNF-α、IL-1β測(cè)定

取3只小鼠斷頭取腦，快速剝離海馬組織，該操作于冰面上完成，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存待用。提取海馬組織蛋白后，按ELISA試劑盒操作說明分別測(cè)量海馬組織中IL-1β及TNF-α細(xì)胞因子水平。

1.3.5 Western blot檢測(cè)海馬組織中IBA-1、Arg-1、iNOS 蛋白的表達(dá)水平

各組取適量海馬組織于高效RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中充分裂解30 min提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加Loading Buffer煮沸后取25 ug蛋白上樣，SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至NC膜，快速封閉液室溫封閉20 min，加入相應(yīng)的一抗置于4℃冰箱過夜，次日TBST洗膜后加入帶HRP熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶10 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜后系統(tǒng)成像，以Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的比值以及各組目的蛋白條帶的比值，進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graph Pad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析組間差異，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察

第7天和第14天對(duì)照組和模型組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (第7天:

t

=0.682，

P

>0.05；第14天：

t

=-0.624，

P

>0.05)。結(jié)果詳見表1。對(duì)照組小鼠未見自發(fā)的癲癇癇性癥狀發(fā)作，第14天腦電圖(EEG)以不規(guī)則基礎(chǔ)波為主(圖1)。第14天模型組小鼠有出現(xiàn)咀嚼、點(diǎn)頭的癇性癥狀，EEG監(jiān)測(cè)可見散在的癇性波(圖1)。第14天模型組注射PTZ后11只小鼠均出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，發(fā)作率為100%，死亡4只，死亡率為36%。

表1 對(duì)照組與模型組小鼠第7天、第14天體質(zhì)量比較(=6，/g)

組別第7天第14天對(duì)照組模型組0.57±0.200.25±0.770.30±0.660.58±0.64

圖1 第14天兩組小鼠的EEG表現(xiàn)

2.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)和存活的變化

對(duì)照組小鼠海馬CA1、CA2及DG區(qū)可見神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)規(guī)則完整，染色質(zhì)分布均勻；尼氏染色均勻。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA1、CA2及DG區(qū)尼氏染色均出現(xiàn)減弱，部分神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮，輪廓模糊，界限不清；細(xì)胞間距增加，排列疏松紊亂(圖2)。

圖2 兩組小鼠海馬組織CA1、CA2及DG區(qū)神經(jīng)元存活情況(Nissl染色,×200)

2.3 對(duì)照組與模型組海馬組織中炎性因子TNF-α、IL-1β的比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織中IL-1β、TNF-α因子均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=-3.58，

P

<0.05)。結(jié)果詳表2。

表2 小鼠海馬組織中TNF-α及IL-1β的表達(dá)情況[=3,/(pg/mL)]

組別TNF-αIL-1β對(duì)照組60.77±7.10135.70±5.93模型組97.40±14.15227.20±32.52

2.4 對(duì)照組與模型組海馬組織中IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白水平的比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的海馬組織中，IBA-1、iNOS顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IBA-1：

t

=-4.85，

P

<0.05；iNOS：

t

=-3.00，

P

<0.05)，p-p38減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=2.93，

P

<0.05)，Arg-1減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=-2.40；

P

>0.05，圖3)。

注：A為Western Blot檢查兩組小鼠海馬組織IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白的表達(dá)水平，B為兩組小鼠海馬組織IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。圖3 兩組小鼠海馬組織中IBA-1、Arg-1及iNOS蛋白水平

3 討論

抗NMDA受體腦炎是最常見的自身免疫性腦炎，約占自身免疫性腦炎的80%，癲癇發(fā)作是腦炎最常見的癥狀之一，然而導(dǎo)致抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇的機(jī)制目前尚不清楚，為進(jìn)一步探討，本研究制作了抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇小鼠模型，基于該模型小鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞極性的改變，為自身免疫性腦炎癲癇發(fā)作所致的炎癥損傷提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果提示，模型組小鼠EEG檢測(cè)到異常放電，海馬組織的神經(jīng)元細(xì)胞受損，小膠質(zhì)細(xì)胞和M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較對(duì)照組增加，炎癥因子IL-1β和TNF-α也明顯增多。

通?？筃MDA受體腦炎患者EEG都有異常放電，表現(xiàn)為彌漫性慢波、過度活動(dòng)β波、極度δ刷和全面性節(jié)律活動(dòng)δ波，EEG的正常與否不但影響著患者的預(yù)后，而且影響著癲癇的復(fù)發(fā)概率。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠EEG檢測(cè)到異常的神經(jīng)元放電，表現(xiàn)為癇性波，這與臨床研究相一致，81.2%的自身免疫性腦炎患者伴有癲癇發(fā)作的癥狀。同時(shí)本研究中抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇小鼠海馬組織CA1、CA2及DG區(qū)出現(xiàn)部分神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，這可能是因?yàn)镹MDA受體的活化介導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒性，引起神經(jīng)元損傷，損傷的神經(jīng)元增加了神經(jīng)元的興奮性，誘發(fā)癲癇發(fā)作，所以小鼠出現(xiàn)咀嚼及點(diǎn)頭等癇性癥狀，EEG存在癇性波。然而本實(shí)驗(yàn)中小鼠EEG沒有表現(xiàn)出抗NMDA受體腦炎患者經(jīng)典的δ刷波形，可能與患病病程有關(guān)。

IL-1β及TNF-α是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的炎癥因子，有研究顯示，癲癇發(fā)作可引起大腦中炎癥因子IL-1β水平升高、海馬中的TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)上調(diào)，本研究結(jié)果提示，小鼠海馬組織中炎癥因子IL-1β及TNF-α表達(dá)水平增高，說明腦部產(chǎn)生了具有炎癥特性的分子免疫反應(yīng)。神經(jīng)元在受到損害、感染等刺激時(shí)通?？梢鹦∧z質(zhì)細(xì)胞的激活、增生，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，增強(qiáng)炎性相關(guān)基因的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可以呈現(xiàn)兩種激活狀態(tài)：經(jīng)典活化狀態(tài)M1型和選擇活化狀態(tài)M2型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)的是促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放如IL-1β、TNF-α及NO等，表達(dá)標(biāo)志物一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞則表達(dá)抑炎性因子，包括IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及精氨酸1(Arginase 1，Arg-1)等，表達(dá)標(biāo)志物Arg-1。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠海馬組織中蛋白IBA-1表達(dá)明顯增加，神經(jīng)元受到了刺激而引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。同時(shí)模型組小鼠海馬組織中iNOS表達(dá)明顯增高，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，Arg-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較沒有明顯變化，抑制炎癥反應(yīng)的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞沒有明顯激活或抑制。這說明該模型可能是以激活的經(jīng)典活化狀態(tài)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞為主，這與Davies等的研究一致。而激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥因子如IL-1β、TNF-α的釋放。以上說明了抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇發(fā)作同樣有這樣的表現(xiàn)，抗NMDA受體抗體和癲癇的發(fā)作刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，炎癥反應(yīng)激活，促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)炎癥因子IL-1β及TNF-α的釋放。

炎癥反應(yīng)有多種激活途徑，p38絲裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen activated，protein kinase，p38MAPK)是其中之一。p38MAPK是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，可以通過調(diào)節(jié)促炎性因子IL-1β及TNF-α等的分泌，影響神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。在其他各種疾病中發(fā)現(xiàn)激活p38 MAPK信號(hào)通路可以使IL-1β、TNF-α大量分泌。既往研究表明，參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活的信號(hào)通路有很多，p38就是其中之一，促進(jìn)p38MAPK蛋白磷酸化可以激活M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥因子。然而本實(shí)驗(yàn)中與之不同的是，模型組小鼠海馬組織磷酸化p38減少，小膠質(zhì)細(xì)胞和M1型小膠質(zhì)細(xì)胞卻仍然被激活，IL-1β、TNF-α分泌增多，推測(cè)抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇模型中，磷酸化p38減少可能跟NMDA受體激活鈣激活/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 Ⅱ (calcium-activated/calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CamKⅡ) 和SynGAP-MUPP1 有關(guān)。

通過本次研究表明，抗NMDA受體腦炎相關(guān)癲癇小鼠海馬組織中神經(jīng)元受損傷，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放炎癥因子IL-1β及TNF-α。