付高爽 孫慶玲 時晶 魏明清 李婷 田金洲

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)多發(fā)于老年人，是癡呆最常見的病因，約占癡呆病例的60%～80%,其表現(xiàn)為思維、記憶、語言能力下降以及性格、行為改變。隨著疾病進展，患者逐漸喪失執(zhí)行簡單日常事務的能力，并最終導致死亡[1]。2018年的數(shù)據(jù)顯示全球有5000萬人患有癡呆，預計2030年達到8200萬人，2050年將翻3倍達到1.52億人[2]。AD不僅嚴重影響患者的生活質量，也給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟和照料負擔，但目前用于治療AD的藥物均無法減緩或阻止神經(jīng)元損傷導致的臨床癥狀及其致命性。

AD屬于中醫(yī)“呆病”范疇，大補元煎出自《景岳全書》，由人參、熟地黃、山藥、杜仲、當歸、山茱萸、枸杞子、甘草8味中藥組成，可治療呆病元氣大虛者?，F(xiàn)代研究表明，大補元煎可改善AD模型鼠學習記憶功能，其作用機制可能與促進神經(jīng)發(fā)生、調節(jié)突觸可塑性、誘導長時程記憶、減輕氧化應激等有關[3-7]。但AD發(fā)病機制和中藥復方的作用機制都十分復雜，網(wǎng)絡藥理學將網(wǎng)絡生物學與多向藥理學整合，揭示多分子藥物協(xié)同作用對于疾病的影響[8-9]，可能有助于尋找大補元煎治療AD的活性成分及效應靶點。

1 材料與方法

1.1 大補元煎活性成分及靶點篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫[10]中(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索人參、山藥、熟地黃、杜仲、當歸、山茱萸、枸杞子、甘草的活性成分，并根據(jù)Pubmed、中國知網(wǎng)已發(fā)表的文獻補充。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)作為依據(jù)，篩選出OB≥30%且DL≥0.18的成分，導入TCMSP平臺獲取對應的靶點。將靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫[11](https://www．uniprot．org)，篩選出已驗證且物種為“Homo sapiens”的靶點，統(tǒng)一為官方推薦的基因名。

1.2 AD疾病靶點篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫[12](https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫[13](http://www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫[14](http://db.idrblab.net)以“Alzheimer disease”為關鍵詞，查詢相關靶點。在DrugBank數(shù)據(jù)庫[15](https://www.drugbank.ca)查詢AD治療藥物的作用靶點予以補充。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，設定相關性評分(Relevance score)>10篩選靶點。對以上4個數(shù)據(jù)庫結果取并集，得到AD的疾病靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡構建

為明確成分靶點與疾病靶點間的相互作用，將二者取交集得到大補元煎治療AD的潛在作用靶點。將交集靶點導入STRING平臺[16](https://string-db.org/)，設定物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為0.9，獲得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)關系，進而利用Cytoscape 3.7.1軟件[17]繪制PPI網(wǎng)絡圖。

1.4 GO生物功能與KEGG通路富集分析

將大補元煎治療AD的潛在靶點導入Metascape平臺[18](http://metascape.org/gp/index.html)，設置P<0.01，進行基因本體 (gene ontology，GO)生物功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，利用ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將數(shù)據(jù)可視化。

1.5 中藥—成分—靶點—通路網(wǎng)絡構建

利用CytoScape 3.7.1軟件構建中藥—成分—靶點—通路網(wǎng)絡圖，其中單味中藥、活性成分、基因靶點、信號通路以節(jié)點(node)表示，各節(jié)點間相互關系以邊(edge)表示。通過Network Analyzer功能分析網(wǎng)絡的主要拓撲參數(shù)，包括連接度、緊密中心度及中介中心度，分析發(fā)揮作用的主要成分及高效應靶點。

2 結果

2.1 大補元煎活性成分及靶點

根據(jù)篩選條件，檢索得到大補元煎各中藥的活性成分及靶蛋白，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫將蛋白名轉換為基因名。剔除無對應靶基因的信息，得到潛在活性成分175個，其中人參17個、山藥12個、熟地黃2個、杜仲25個、當歸2個、山茱萸14個、枸杞子36個、甘草88個(部分成分同時存在于多個中藥)。進一步檢索得到各中藥的作用靶點，人參113個、山藥76個、熟地黃31個、杜仲208個、當歸52個、山茱萸68個、枸杞子198個、甘草229個。將靶點取并集，共得到潛在靶點272個。

2.2 AD疾病相關靶點

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得靶點1461個，從OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得靶點284個，從TTD數(shù)據(jù)庫中獲得靶點140個，從DrugBank數(shù)據(jù)庫中獲得靶點89個。將4個數(shù)據(jù)庫的結果取并集，共得到AD相關靶點1651個。

2.3 AD成分靶點PPI網(wǎng)絡

將大補元煎成分靶點與AD疾病靶點取交集，得到大補元煎治療AD的潛在靶點187個，導入STRING平臺，隱藏16個游離節(jié)點，得到PPI關系數(shù)據(jù)。在CytoScape3.7.1軟件中，設置節(jié)點度(degree)值越大節(jié)點越大，顏色越深，結合評分(combined score)越高邊越粗，繪制PPI網(wǎng)絡圖，共涉及171個節(jié)點，901條邊，見圖1。其中信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、淀粉樣-β前體蛋白(APP)、RAC-a絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、轉錄因子AP-1(JUN)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)節(jié)點度較大，表明這些基因在PPI網(wǎng)絡中具有重要意義，可能是大補元煎治療AD的高效應靶點，見表1。

表1 PPI網(wǎng)絡中高效應靶點參數(shù)

2.4 GO生物功能與KEGG通路富集分析

對大補元煎治療AD的潛在靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，將每個富集結果的前20條可視化。分子功能分析顯示，這些靶點主要涉及G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、激酶結合、蛋白結構域特異性結合、DNA結合轉錄因子結合、兒茶酚胺結合等(見圖2A)。細胞組分分析顯示，靶點主要涉及膜筏、樹突、突觸后膜、受體復合物、囊泡腔等(見圖2B)。生物過程分析顯示，靶點涉及細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、血液循環(huán)、炎癥反應、對脂多糖的反應、活性氧代謝過程等(見圖2C)。KEGG通路分析顯示，大補元煎治療AD的機制可能與癌癥通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、cAMP 信號通路、p53信號通路、5-羥色胺能突觸等有關(見圖2D)。

圖1 大補元煎治療AD潛在靶點的PPI網(wǎng)絡圖

注：A分子功能；B細胞組分；C生物過程；D：KEGG通路。

2.5 中藥—成分—靶點—通路網(wǎng)絡

根據(jù)藥物與疾病的187個交集靶點，再次對活性成分進行篩選，得到與靶點有關的成分156個。以8味中藥、156個活性成分、187個靶點和20條相關通路為基礎，構建中藥—成分—靶點—通路網(wǎng)絡(見圖3)。節(jié)點的連接度越大則與其他節(jié)點的連接關系越多，緊密中心度越大則該節(jié)點越接近網(wǎng)絡中心位置，中介中心度越大則該節(jié)點在維持網(wǎng)絡緊密連接性中越重要?；钚猿煞种械拈纹に?quercetin)、山奈酶(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、Cinchonan-9-al, 6′-methoxy-，(9R)-、(-)-Tabernemontanine、異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)等連接度、緊密中心度、中介中心度較高，可能是大補元煎治療AD的主要成分(見表2)。靶點中的前列腺素G/H合酶2(prostcglandin G/H synthase and cyclooxygenase,PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、胰蛋白酶-1(PRSS1)、鈉通道蛋白5型亞基α(SCN5A)、鈣調蛋白-1(calmodulin 1,CALM1)等連接度、緊密中心度、中介中心度較高，可能是大補元煎治療AD的高效應靶點(見表3)。

3 討論

AD屬于一種神經(jīng)退行性疾病，病理特征包括神經(jīng)元及神經(jīng)連接的損傷和丟失、纖維纏結、淀粉樣蛋白斑塊和炎癥[19]。目前，臨床用于治療AD的藥物主要有膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏)和谷氨酸受體拮抗劑(美金剛)，但它們均不能阻止或逆轉疾病進展。張景岳認為呆病病因復雜，表現(xiàn)“千奇萬怪，無所不至”，治療之機在于“胃氣元氣之強弱”，因此扶助元氣對于呆病的治療尤為重要，以大補元煎救本培元、補益氣血，因此大補元煎治療AD具備中醫(yī)理論支撐。但是現(xiàn)有研究尚未完全闡明大補元煎治療AD的藥理機制，本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法，從成分、靶點、途徑等多角度對大補元煎的有效成分和作用機制進行了分析。

注：三角形代表中藥；圓形代表活性成分；菱形代表靶點；箭頭代表通路。節(jié)點越大代表度值越大。

表2 大補元煎主要活性成分網(wǎng)絡參數(shù)

表3 大補元煎治療AD高效應靶點網(wǎng)絡參數(shù)

本研究共篩選出175個活性成分，主要發(fā)揮治療作用的成分可能是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，這些成分通過抑制Aβ聚集和Tau磷酸化、抑制乙酰膽堿水解、減輕氧化應激、抑制炎癥、改善神經(jīng)元可塑性發(fā)揮神經(jīng)保護作用。槲皮素干擾Aβ寡聚體形成以減輕其神經(jīng)毒性[20]，通過MAPK和PI3K/Akt/GSK3β信號通路逆轉Tau過度磷酸化[21]，競爭性抑制AChE以抑制乙酰膽堿水解[22]，誘導Nrf-2-ARE和PON2以增強細胞抗氧化能力[23]，以及通過減少NO產生、小膠質細胞iNOS基因表達、炎癥因子產生來抑制神經(jīng)炎癥[24-25]。山奈酚上調谷胱甘肽和SOD活性以對抗ROS毒性，通過NF-κB、p38MAPK、AKT通路抑制炎癥，促進BDNF表達以改善神經(jīng)元可塑性[26]。β-谷甾醇、豆甾醇均可促進APP的非淀粉樣生成，清除自由基，減輕氧化應激損傷[27-30]。

本研究共篩選出187個潛在靶點，綜合PPI網(wǎng)絡與中藥—成分—靶點—通路網(wǎng)絡，參數(shù)值較高的有APP、STAT3、PTGS2、PTGS1、AR等，可能是大補元煎的高效應靶點。這些靶點均被證明在AD腦中發(fā)生變化，與Aβ聚集和炎癥過程相關。APP是Aβ前體蛋白，Aβ寡聚體和纖維聚集物是AD腦內重要的病理改變，Aβ寡聚體具有較強的神經(jīng)毒性，Aβ纖維聚集物可引起氧化損傷和炎癥反應[31-33]。STAT3是星形膠質細胞增生的典型誘導因子，在AD腦中被激活，STAT3基因缺陷可上調Aβ清除途徑，減輕炎癥因子激活，降低受損突觸負荷[34]。PTGS2與PTGS1是將花生四烯酸轉化為前列腺素H2的同工酶，前列腺素合成增加引起膠質細胞產生促炎因子水平增加，導致神經(jīng)元死亡[35]。抑制PTGS1和PTGS2可調節(jié)去甲腎上腺素和多巴胺水平相關通路的基因表達，抵消Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性[36]。AR是雄激素受體，生理濃度的雄激素能促進小膠質細胞吞噬和清除Aβ42并抑制炎癥反應，老年男性較低的雄激素水平是AD的危險因素，而女性患遲發(fā)性AD的風險是男性的2倍[37-38]。

KEGG通路富集分析顯示，相關性較高的有癌癥通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、cAMP 信號通路、p53信號通路、5-羥色胺能突觸等。根據(jù)顯著性和富集的靶點數(shù)量分析，癌癥通路的相關性最高。流行病學研究表明，癌癥與AD的發(fā)生呈負相關，一些共同的生物學機制對二者產生相反的效應，涉及p53、PIN1、Erk、PKC等[39-40]。p53信號通路也是本研究富集到的通路之一，它被DNA損傷、氧化應激、癌基因激活等多種應激信號激活，產生細胞周期停滯、細胞衰老或凋亡的效應。Aβ42也可直接結合并激活p53啟動子，導致神經(jīng)元凋亡[41]。PIN1、Erk1/2、PKC均可促進APP的非淀粉樣切割，PIN1還能抑制Tau過度磷酸化，在AD和輕度認知障礙患者中低水平表達[40,42-43]。

本研究系統(tǒng)闡述了大補元煎治療AD的物質基礎和可能的作用機制，從藥理學角度科學地體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念。在后續(xù)研究中，可以對篩選出的靶點和通路進行驗證，從而為經(jīng)典名方大補元煎的臨床應用奠定更加堅實的基礎。