劉偉 梁綿杰 姜可園 謝莉瑩 王雪玭 張笑雪

肺癌是目前世界已知患病率最高的癌癥之一[1]，世衛(wèi)組織最新的權威數(shù)據(jù)顯示[2-3]，僅2020年全世界腫瘤患者就新增了1930萬例，死亡患者為1000萬例；其中肺癌分別為220萬(11.4%)和180萬(9%)，死亡患者數(shù)量居于榜首?？v觀全球，我國是新發(fā)肺癌最多的國家，約為82萬(17.9%)，占全球新發(fā)肺癌的37%，位居前列。隨著大氣污染和人口老齡化的加劇，肺癌的患病率逐年增加，至2025年預計中國肺癌發(fā)病人數(shù)將達到100萬/年[4]。肺癌不僅產(chǎn)生巨額醫(yī)療費用，更重要的是嚴重影響患者生活質(zhì)量，故而尋求不同的肺癌的治療方案意義重大。

天津中醫(yī)藥大學孫增濤教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗和實驗研究以益氣溫陽散瘀為法，創(chuàng)制出益氣溫陽顆粒用以治療肺部腫瘤，臨床上取得了一定的療效，在延緩腫瘤進展的同時，對于改善患者生存質(zhì)量大有裨益。但因腫瘤的成因極為復雜，是多種因素共同影響的結(jié)果，故益氣溫陽顆粒具體的抗腫瘤機制目前尚不清楚。

自腫瘤依賴血管生成假說被Folkman等[5]人提出以來，便一直是學界的研究熱點。2004年美國FDA批準了貝伐珠單抗應用于臨床腫瘤治療，這是第一種運用于臨床的抗腫瘤血管生成藥物，其主要通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)結(jié)合，使得腫瘤血管生長受抑，從而達到控制腫瘤生長的目的。但近年臨床發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗存在包括異常出血[6]、蛋白尿[7]等在內(nèi)的諸多不良反應，并且長期使用較易產(chǎn)生耐藥性。而中醫(yī)藥在控制腫瘤血管生成方面同樣存在著一定的優(yōu)勢，且副作用小[8]。故本實驗通過檢測益氣溫陽顆粒聯(lián)合貝伐珠單抗對Lewis荷瘤小鼠腫瘤組織中反映微血管密度(microvessel density，MVD)的血小板—內(nèi)皮細胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)，以及與腫瘤血管生成相關的VEGF、VEGFR-2的影響，探討益氣溫陽顆粒聯(lián)合貝伐珠單抗可能存在的抗腫瘤血管生成機制，以期為中西醫(yī)結(jié)合治療肺部腫瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、瘤株

清潔級近交系C57BL/6J雄性小鼠40只，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：1100111911037746；小鼠Lewis肺癌瘤株，中國科學院上海生命科學研究院。本實驗通過中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物倫理委員會審核(編號：IRM-DWLL-2019140)。

1.2 實驗藥物

益氣溫陽顆粒由黃芪20 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿9 g、黨參15 g、薏苡仁20 g、雞內(nèi)金9 g、桔梗9 g、莪術10 g、虎杖10 g、甘草6 g組成，由天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房提供；貝伐珠單抗注射液(安維汀)100 mg，規(guī)格：4 mL/瓶，購自Roche Pharma(Switzerland)Ltd.，批號：H0210B06。

1.3 實驗試劑與儀器

免疫組化試劑盒(批號：IHC003)、VEGFR-2一抗(批號：bs-10412R)、CD31一抗(批號：bsm-10825M)均購于北京博奧森生物技術有限公司；PCR試劑盒(批號：DRR420A)、超純RNA提取試劑(批號： D9108B)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：DRRO47A)均購于寶生物工程(大連)有限公司。

顯微鏡(BX51T-PHD-J11，Olympus Corporation)，CMOS(UCMOS00350KPA，Olympus Corporation)，分光光度計(NANODROP 2000，Therno scientific)，熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)，多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)。

1.4 建立小鼠模型

取液氮保存的Lewis肺癌細胞系，用37℃水浴融化，加入RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，傳代。再將培養(yǎng)后的Lewis細胞用胰蛋白酶消化，將細胞濃度調(diào)整為1×107個/mL的瘤細胞懸液。取40只小鼠，在每只小鼠右腋窩脫毛，消毒后，充分搖勻細胞液后皮下接種0.2 mL。5天后若可在接種部位觸及瘤體，即造模成功。

1.5 藥物制備

益氣溫陽顆粒用蒸餾水配制成含生藥0.1 g/mL的藥液，置于4℃冰箱中保存；貝伐珠單抗注射液經(jīng)生理鹽水配制成含貝伐珠單抗?jié)舛葹?.4 mg/mL的藥液供小鼠實驗使用。

1.6 分組及給藥

將造模成功后的荷瘤小鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥組及中西聯(lián)合用藥組，共4組，每組10只。小鼠的藥量計算方式據(jù)徐叔云主編的《藥理實驗方法學》第三版中“動物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”進行折算。具體給藥方式如下：模型組：每天灌胃生理鹽水0.4 mL，連續(xù)14天；西藥組(貝伐珠單抗)：貝伐珠單抗腹腔注射，15 mg/kg，每周2次，連續(xù)兩周；中藥組(益氣溫陽顆粒)：每天灌胃益氣溫陽顆粒20 g生藥/kg，連續(xù)14天；中西聯(lián)合用藥組(益氣溫陽顆粒+貝伐珠單抗)：每天灌胃益氣溫陽顆粒20 g生藥/kg，連續(xù)灌胃14天以及貝伐珠單抗腹腔注射，15 mg/kg，每周2次，連續(xù)兩周。

1.7 檢測抑瘤率

第14天給藥后2小時處死小鼠，將腫瘤組織取出后用生理鹽水漂洗干凈殘血，吸干水分，計算抑瘤率。

1.8 檢測指標

1.8.1 VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平 RT-PCR法檢測VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平，具體步驟嚴格按試劑盒所示進行。PCR引物序列由上海生物工程技術服務有限公司合成，詳見表1。

表1 引物序列

1.8.2 腫瘤組織VEGFR-2、CD31表達水平 通過陽性細胞計數(shù)百分比和細胞染色強度的綜合評價，對免疫組化反應進行分析，計算二者評分的乘積即為免疫組化評分，詳見表2。

表2 免疫組化評分標準

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 瘤重、抑瘤率

與模型組相比，藥物組瘤重均有下降，其中聯(lián)合用藥組最小，而中藥組腫瘤最大，且各藥物組中聯(lián)合用藥組抑瘤率最高，但差異均不顯著(P>0.05)。具體見表3。

表3 各組Lewis小鼠瘤重、抑瘤率的比較

2.2 VEGF基因表達

β-actin的擴增曲線、溶解曲線見圖1；VEGF的擴增曲線、溶解曲線見圖2。β-actin與VEGF擴增曲線均拐點清楚，指數(shù)期明顯，基線平且無上揚現(xiàn)象，整體平行性、重復性好，呈典型“S”型曲線，Ct值分別為：22～26和16～25；β-actin與VEGF的溶解曲線均為單峰，產(chǎn)物特異性高，峰值分別出現(xiàn)在84.73℃與86.69℃。

藥物組VEGF mRNA表達均顯著低于模型組(P<0.01)，聯(lián)合用藥組最低，并優(yōu)于中藥組(P<0.01)，表明益氣溫陽顆粒和貝伐珠單抗均可顯著降低VEGF在小鼠腫瘤中的表達，且聯(lián)合用藥療效最好。具體見表4。

2.3 VEGFR-2、CD31表達

聯(lián)合用藥組與模型組比較，小鼠腫瘤組織VEGFR-2的表達顯著下降(P<0.01)，其它藥物組與模型組相比，均有下降，但差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與聯(lián)合用藥組相比，模型組、中藥組

圖1 β-actin擴增及溶解曲線

圖2 VEGF擴增及溶解曲線

表4 各組Lewis小鼠腫瘤組織中

CD31表達均有統(tǒng)計學差異(P<0.01，P<0.05)，其他治療組雖然均有下降，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明益氣溫陽顆粒和貝伐珠單抗均可在一定程度上下調(diào)VEGFR-2、CD31的表達，且聯(lián)合用藥療效顯著而確切。具體見表5、圖3～4。

表5 各組Lewis小鼠腫瘤組織中VEGFR-2、 CD31免疫組化評分比較

注：A 模型組；B 西藥組；C 中藥組；D 聯(lián)合用藥組。

注：A 模型組；B 西藥組；C 中藥組；D 聯(lián)合用藥組。

3 討論

作為一種消耗性疾病，腫瘤的快速增殖需要大量營養(yǎng)支持，腫瘤血管生成就是其“掠奪”營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式之一，這也是癌癥患者身體狀況呈斷崖式下跌的主因。當腫瘤體積超過2 mm2后，在缺血缺氧條件的刺激下，腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等生成大量VEGF，其與血管生成抑制因子之間的動態(tài)平衡被打破，使得腫瘤內(nèi)部微血管野蠻生長。MVD是組織單位面積下的微血管數(shù)量，可以很好的反應腫瘤組織新血管生成、血運狀態(tài)以及腫瘤的生長情況[9]，而CD31是內(nèi)皮細胞標志物的一種，對于新生血管具有特異性，可以很好反映組織中的MVD，廣泛應用于肺癌組織新血管生成情況的評價。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)功能性及專屬性最強的血管生成因子,多生成于血管周圍細胞，通過旁分泌的方式對內(nèi)皮細胞起作用，作為一種特異性的有絲分裂原，其可以強效作用于內(nèi)皮細胞，促進形成新血管，使得內(nèi)皮細胞死亡減少，同時還可以提高血管通透性。研究表明，VEGF在肺部腫瘤組織(荷瘤小鼠細胞、人體肺癌組織等)中均呈高表達狀態(tài)[7]。作為VEGF的受體，VEGFR-2與VEGF的結(jié)合是VEGF表達的必要條件，故VEGFR-2也是影響血管生成的直接因素之一[10]。VEGFR-2是酪氨酸激酶受體的一種，特異性的表達于血管內(nèi)皮細胞，有著極其強大的酪氨酸激酶活性。低氧條件下，VEGF與VEGFR-2相結(jié)合后被活化，使得內(nèi)皮細胞分裂分化為管腔樣的結(jié)構，還能使PI3K/AKT通路激活，促使磷脂酰肌醇得以磷酸化，釋放磷鈣離子、蛋白酶C和第二信使，增加血管內(nèi)皮細胞的分裂，減少凋亡，促進血管細胞解離，造成血管通透性上升，不僅使纖維蛋白原等蛋白質(zhì)外露形成纖維凝膠，促進毛細血管生成，為腫瘤細胞的增殖提供血氧支持，還可以制造適合腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)境[11]。研究表明，在小鼠肺移植瘤中VEGF呈過表達狀態(tài)[12]，而通過阻斷VEGF的表達，腫瘤及其血管的生長均受到抑制[13-14]。綜上，VEGF/VEGFR-2血管生成通路是腫瘤增殖過程中重要環(huán)節(jié)。

課題組前期對肺癌及肺結(jié)節(jié)進行文獻[15-16]梳理后發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)對肺癌的認識總為本虛標實，由古而今，變者甚微。其本虛者多以氣血陰陽立論，其標實者，則以痰、瘀為多。孫增濤教授則認為，肺癌正虛在于氣陽兩虛，邪盛在于瘀血為患，這也是腫瘤血管快速不規(guī)則增生而形成不成熟、無序紊亂小血管的內(nèi)在原因：肺者主氣，司呼吸，是統(tǒng)御全身之宗氣形成的重要環(huán)節(jié)；氣者帥血，氣行則血行，肺病日久，清氣攝入不足，而宗氣合化失源，而致氣虛。一則無力助肺司呼吸，肺傷氣虛愈甚；二則助心行血乏源，不僅無力推動血液的運行，血流緩慢，瘀阻于局部，而且無力統(tǒng)攝血在脈道中循經(jīng)而行，以致血運失常以妄行，二者共同造成腫瘤血管生長紊亂；同時血為氣之母，血液瘀阻、妄行，又進一步傷氣，形成惡性循環(huán)。且氣虛日久，陽氣必殃，陽氣虛則推動溫煦無力，血寒則凝，瘀于局部，瘤體乃成。故有專家研究認為，瘀血內(nèi)結(jié)是腫瘤血管生成的病理變化[17]。本課題組前期對原發(fā)性肺癌的文獻統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，氣虛患者占比最多，可達35.42%[18]；同時，對于肺結(jié)節(jié)患者(包括惡性肺結(jié)節(jié)患者)的體質(zhì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在偏頗體質(zhì)中，氣虛與陽虛所占比例最大，且貫穿惡性肺結(jié)節(jié)始終，這些發(fā)現(xiàn)均佐證了益氣溫陽法治療肺部腫瘤的合理性[19]。

益氣溫陽顆粒全方由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿、黨參、雞內(nèi)金、莪術、虎杖、雞內(nèi)金、桔梗、甘草組成，方中黃芪入肺、脾兩經(jīng)，既補肺益氣，又培土生金，淫羊藿入腎經(jīng)，補腎助陽，二者益氣溫陽，金水相生共為君藥；臣以黨參、雞內(nèi)金補氣健脾益肺，肉蓯蓉溫腎補陽，以加強益氣溫陽之效；莪術破血行氣消癥，虎杖活血祛瘀止痛，雞內(nèi)金健脾消積散結(jié)，三者為佐藥，共奏祛瘀消瘤之用；桔梗入肺且為舟楫，載藥上行，引諸藥，達病所，甘草則性和，藥中“國老”，調(diào)和諸藥，共為使藥。全方君臣佐使相配，以益氣溫陽為本，祛瘀散結(jié)為標，標本兼顧，同時補而不滯，祛邪而不傷正，在多年的臨床中療效顯著。現(xiàn)代研究表明，方中黃芪所含有的黃芪多糖可以通過下調(diào)VEGF表達抑制腫瘤血管的生長[20]；與黨參聯(lián)用后，可以明顯增強紫杉醇抑制腫瘤MVD的作用[21]；桔梗中提取的皂苷類組分也有著同樣的作用[22]；淫羊藿的主要血管活性成分淫羊藿甙[23]，莪術中提取的有效單體成分莪術醇[24]，以及虎杖中的白藜蘆醇均有下調(diào)VEGF的作用[25]。

本實驗表明，在益氣溫陽顆粒、貝伐珠單抗、益氣溫陽顆粒聯(lián)合貝伐珠單抗的干預下，與模型組相比，各用藥組VEGF mRNA在肺癌組織中的表達均可顯著性下降，聯(lián)合用藥尤佳；聯(lián)合用藥可以顯著下調(diào)小鼠腫瘤組織中的VEGFR-2、MVD(CD31)；VEGF、VEGFR-2、MVD的表達，且與瘤重呈正性相關。在腫瘤重量方面，各治療組與模型組相比，瘤重均有下降，其中聯(lián)合用藥組下降最為明顯，抑瘤率可高達26.97%，但未發(fā)現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學意義?？赡芘c藥量的使用、治療時間等方面的因素存在一定的關系，需要在后續(xù)的研究中深入探討。

綜上所述，益氣溫陽顆粒聯(lián)合貝伐珠單抗可以通過調(diào)控VEGF/VEGFR-2這一關鍵的血管生成通路，下調(diào)VEGF和VEGFR-2的表達，有效減少腫瘤新血管生成，同時使已形成的微血管衰亡，降低MVD，還能在一定程度上抑制肺部腫瘤生長，延緩肺癌進展。