高艷艷 秦銘 徐廣 吉莉 郭宇瑛 李顏伶 馬群

防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.為傘形科植物防風(fēng)的干燥根，味辛、甘，性微溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)[1]。臨床上防風(fēng)為治療濕疹、蕁麻疹、特異性皮炎等過(guò)敏性疾病引起皮膚瘙癢的首選藥。防風(fēng)多糖是防風(fēng)重要的活性成分，具有抗腫瘤、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[2-4]。目前關(guān)于防風(fēng)多糖的研究主要集中在單糖組成[5-6]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[3]等方面，抗過(guò)敏作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及新劑型的研發(fā)較少。

溫敏凝膠劑是以溶液狀態(tài)給藥后，利用高分子材料對(duì)外界溫度的響應(yīng)發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠的制劑[8]。溫敏凝膠劑給藥后能粘附于給藥部位，使局部藥物濃度升高，達(dá)到并維持有效藥物濃度。其具有作用時(shí)間長(zhǎng)，避免首關(guān)效應(yīng)，減少毒副作用[9]等特點(diǎn)。普通凝膠給藥時(shí)需要人為的涂抹，使用存在一定的不便，而且給藥時(shí)容易損傷皮膚，造成二次損傷，對(duì)于大面積創(chuàng)傷難以保證給藥均勻，而溫敏凝膠能有效避免此類(lèi)情況發(fā)生，尤其適合做各種中藥提取物的給藥載體[10-11]。

隨著中藥外用制劑的不斷發(fā)展，“內(nèi)病外治”已成為今后研究發(fā)展方向之一。課題組前期研究表明防風(fēng)多糖具有較好的抗過(guò)敏活性，本研究將防風(fēng)有效部位制備成溫敏凝膠，使藥物直接作用于病變部位并維持較高的血藥濃度，延長(zhǎng)作用時(shí)間。藥物釋放與凝膠溶蝕同時(shí)進(jìn)行，更好地發(fā)揮緩釋作用，且解決了普通凝膠分散不均勻問(wèn)題，提高患者順應(yīng)性，提高藥物的生物利用度，為臨床外用緩釋制劑的制備提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

防風(fēng)(北京三和藥物有限公司)，稱(chēng)取防風(fēng)切片600 g置于圓底燒瓶中，加入10倍量蒸餾水，加熱回流提取三次，每次1.5小時(shí)，合并提取液。提取液濃縮至生藥含量1 g/mL時(shí)進(jìn)行醇沉，乙醇終濃度為80%，于4℃靜置12小時(shí)濾去上清液，取沉淀干燥，得防風(fēng)粗多糖。采用Sevage法除蛋白，采用大孔樹(shù)脂法除色素，得到防風(fēng)多糖。

泊洛沙姆407(GND32821B)、泊洛沙姆188(GNE03221B)，購(gòu)自德國(guó)BASF公司；甘油(批號(hào)：20150328)、丙二醇(批號(hào)：20130612)，購(gòu)自北京化工廠；苯甲酸(批號(hào)：20120910)，購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠；葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：B21882)、薄荷油(批號(hào)：S24778)、山梨醇(批號(hào)：S11057)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；氮酮(批號(hào)：XW00503391)、聚乙烯吡咯烷酮K30(批號(hào)：30154481)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)羥基苯甲酸甲酯(批號(hào)：20150613)， 購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-52AA)；恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)：HH-S6)；超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-400KDE)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TDL-50B)；實(shí)驗(yàn)室用pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號(hào)：FE20)；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司，型號(hào)：TU-1901)；RTC Basic磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司，型號(hào)：IKA)；SPECTRO star Nano酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG LABTECH公司，型號(hào)：DNM-9602)；恒溫振蕩器(常州金壇良友儀器有限公司，型號(hào)：ZD-85)。

1.2 溫敏凝膠的制備工藝

采用冷凝法制備溫敏凝膠。精密量取一定量純化水，加入準(zhǔn)確稱(chēng)量的泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)，放入4℃冰箱至充分溶脹，得澄清透明的空白原位凝膠。取適量防風(fēng)多糖樣品加入凝膠基質(zhì)中，混合均勻，制得防風(fēng)多糖溫敏凝膠劑。

1.3 膠凝溫度的測(cè)定

取適量溫敏凝膠于燒杯中，磁力攪拌器設(shè)置轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，以1～2℃/分鐘的速率緩慢升溫，觀察溶液狀態(tài)變化，直至燒杯倒置后溶液不再流動(dòng)，此時(shí)溫度定義為膠凝溫度(T)，測(cè)定3次取平均值。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 凝膠基質(zhì)篩選 (1)P407濃度對(duì)膠凝溫度的影響：配制濃度為15%～25%的P407溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其膠凝溫度，每種濃度測(cè)定3次，取平均值。(2)P188濃度對(duì)膠凝溫度的影響：配制濃度為40%～80%的P188溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其膠凝溫度，每種濃度測(cè)定3次，取平均值。(3)P407與P188濃度對(duì)膠凝溫度的影響：根據(jù)上述考察結(jié)果，固定P407濃度(16%、18%、20%)，分別向其中加入不同濃度的P188(0.5%～5%)，按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其膠凝溫度，每種濃度測(cè)量3次，取平均值。

1.4.2 多糖加入對(duì)基質(zhì)膠凝性質(zhì)的影響 以含2%多糖的P407/P188(20%/1%)凝膠溶液考察制劑配制方式，方法如下：A多糖用足量蒸餾水使完全溶解，將基質(zhì)加入多糖水溶液中，置4℃冷藏24小時(shí)，使其完全溶脹；B將基質(zhì)加入足量蒸餾水中，置4℃冷藏24小時(shí)，使完全溶脹，再將多糖加入空白基質(zhì)溶液中。按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其膠凝溫度。

1.5 Box-Benhnken法優(yōu)化溫敏凝膠制備工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇P417、P188、PVP-K30、甘油的濃度作為考察因素，膠凝溫度作為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行處方優(yōu)化，范圍分別為：P417濃度(A)為16%～24%，P188濃度(B)為1%～5%，PVP-K30濃度(C)為0.1%～0.5%，甘油濃度(D)為1%～10%。對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，以膠凝溫度30～32℃為擬合范圍得到最優(yōu)處方。

1.6 質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.6.1 含量測(cè)定 精密稱(chēng)取防風(fēng)多糖溫敏凝膠50 mg于25 mL容量瓶中，加適量水超聲15分鐘后定容至刻度。制備3批樣品采用苯酚-硫酸法測(cè)定總多糖含量，具體操作參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》[12]。

1.6.2 外觀性狀 取制備的適量防風(fēng)多糖溫敏凝膠分別在室溫條件下與31℃左右的皮膚表面觀察凝膠的性狀。

1.6.3 pH值 稱(chēng)取適量防風(fēng)多糖溫敏凝膠3份置于西林瓶中，用pH計(jì)測(cè)定其pH值，每份測(cè)量3次取平均值。

1.6.4 黏度 稱(chēng)取防風(fēng)多糖溫敏凝膠3份置于西林瓶中，用NDJ-8S黏度計(jì)4號(hào)轉(zhuǎn)子測(cè)定其黏度，每份測(cè)量3次取平均值。

1.6.5 穩(wěn)定性 (1)一般穩(wěn)定性試驗(yàn)：取防風(fēng)多糖溫敏凝膠3份，將其置于4℃、25℃、40℃環(huán)境下一周，分別于第1、4、7天取樣觀察，以溫敏凝膠的外觀性狀、含量、pH為指標(biāo)，考察其穩(wěn)定性。(2)耐熱耐寒試驗(yàn)：將防風(fēng)多糖溫敏凝膠劑分別置于6個(gè)具塞試管中，其中3份置60℃恒溫干燥箱中6小時(shí)，另3份置-20℃冰箱中24小時(shí)，觀察凝膠的外觀變化。(3)離心試驗(yàn)：取防風(fēng)多糖溫敏凝膠3份置于離心管中，3000 r/分鐘，離心30分鐘，觀察其外觀變化、均勻程度以及是否分層。

1.6.6 溶蝕動(dòng)力學(xué)與釋藥行為考察 采用無(wú)膜溶出法測(cè)定溫敏凝膠的溶蝕動(dòng)力學(xué)，并考察藥物的釋放。精密稱(chēng)取防風(fēng)多糖溫敏凝膠5 g，加入到質(zhì)量為W0的具塞試管中，置于37℃恒溫振蕩器中預(yù)熱10分鐘，完全形成半固體凝膠后稱(chēng)重W1。加入5 mL同溫度pH=7.2的PBS緩沖液，振動(dòng)頻率為100 r/分鐘，每隔30分鐘傾倒出全部釋放介質(zhì)另存，將試管表面拭干，迅速稱(chēng)量并記錄其質(zhì)量為Wt。緩慢補(bǔ)加同溫度釋放介質(zhì)5 mL，放入恒溫振蕩器中繼續(xù)上述操作，直至試管內(nèi)溶液全部倒出，相鄰時(shí)間點(diǎn)間質(zhì)量差異即為凝膠累積溶蝕率，計(jì)算公式為Q(%)=W1-Wt)/(W1-W0)×100%。以凝膠累積溶蝕率對(duì)取樣時(shí)間作圖，得到凝膠經(jīng)時(shí)溶蝕曲線。另外，取上述另存的釋放介質(zhì)，按“1.6.1”項(xiàng)下方法測(cè)定防風(fēng)多糖含量，以累積釋藥率對(duì)取樣時(shí)間作圖，得到凝膠釋藥曲線。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 凝膠基質(zhì)篩選 P407濃度對(duì)膠凝溫度影響顯著，如圖1所示，當(dāng)P407濃度在15%～25%之間時(shí)，隨著P407濃度升高，膠凝溫度呈下降趨勢(shì)，表明膠凝溫度對(duì)P407濃度的大小有依賴性。如圖2所示，當(dāng)P188濃度在40%～80%之間時(shí)，隨著P188濃度升高，膠凝溫度呈下降趨勢(shì)，濃度80%時(shí)，膠凝溫度在30℃左右才符合皮膚給藥溫度。由圖3可知，當(dāng)P407的濃度一定時(shí)，膠凝溫度隨著P188濃度(0.5%～5%)的增大而升高。因此，本實(shí)驗(yàn)將P407與P188兩種基質(zhì)聯(lián)合使用，調(diào)節(jié)溫敏凝膠皮膚給藥的最適溫度。

圖1 不同濃度P407對(duì)膠凝溫度的影響(n=3)

圖2 不同濃度P188對(duì)膠凝溫度的影響(n=3)

圖3 不同濃度的P407與P188對(duì)膠凝溫度的影響(n=3)

2.1.2 多糖加入對(duì)基質(zhì)膠凝性質(zhì)的影響 如表1所示，多糖的加入對(duì)溫敏凝膠膠凝溫度影響較小。根據(jù)凝膠外觀及膠凝溫度的變化，選擇B項(xiàng)加入方式。

表1 多糖加入對(duì)基質(zhì)膠凝性質(zhì)的影響(n=3)

2.2 Box-Benhnken法優(yōu)化溫敏凝膠處方

采用Box-Benhnken試驗(yàn)來(lái)考察關(guān)鍵工藝參數(shù)與工藝優(yōu)化指標(biāo)之間的相互關(guān)系，進(jìn)行處方優(yōu)化。結(jié)果表明P407、P188、PVP-K30、甘油濃度、P407濃度和甘油濃度的交互作用對(duì)溫敏凝膠的膠凝溫度都有顯著影響。結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Export 8.0軟件進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式模型的回歸方程Y=36.18-10.74×A+4.28×B+2.51×C+2.14×D+1.23×A×B-0.15×A×C-3.10×A×D-1.37×B×C-0.52×B×D-0.35×C×D+0.13×A2-2.29×B2+0.46×C2+0.41×D2。對(duì)該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，P<0.0001，說(shuō)明二次多項(xiàng)式模型顯著性良好，該模型擬合程度良好，可以為溫敏凝膠處方組成提供參考。由該模型預(yù)測(cè)的處方組成為P407濃度19.4%，P188濃度1.4%，PVP-K30濃度0.1%，甘油濃度6.0%，膠凝溫度約為30.5℃。

表2 Box-Benhnken設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.3 防風(fēng)多糖溫敏凝膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 含量測(cè)定 采用苯酚—硫酸法測(cè)定防風(fēng)溫敏凝膠中總多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.2 外觀性狀 常溫下，防風(fēng)多糖溫敏凝膠為質(zhì)地均勻的黃棕色液體。加熱到31℃時(shí)，液體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w物質(zhì)，質(zhì)地均勻細(xì)膩，有一定黏度，涂展性良好。如圖4所示。

表3 以膠凝溫度為響應(yīng)值的 回歸模型方差分析表

表4 防風(fēng)多糖溫敏凝膠總多糖含量測(cè)定結(jié)果

2.3.3 pH值 防風(fēng)多糖溫敏凝膠的pH為5.41，符合外用凝膠劑的pH要求。

2.3.4 黏度 防風(fēng)多糖溫敏凝膠的黏度測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表5，均值為344143 mPa·S。

表5 防風(fēng)多糖溫敏凝膠黏度測(cè)定結(jié)果

2.3.5 穩(wěn)定性 (1)一般穩(wěn)定性：如表6所示，防風(fēng)多糖溫敏凝膠在3種環(huán)境下未發(fā)現(xiàn)外觀形態(tài)改變，pH與含量無(wú)明顯變化。(2)耐熱耐寒穩(wěn)定性：防風(fēng)多糖溫敏凝膠外觀未發(fā)生變化，未分層沉降，質(zhì)地均勻。(3)離心試驗(yàn)：防風(fēng)多糖溫敏凝膠外觀未發(fā)生變化，未分層，質(zhì)地均勻。

表6 不同溫度下防風(fēng)多糖溫敏凝膠的穩(wěn)定性

2.3.6 溶蝕動(dòng)力學(xué)與釋藥行為考察 溫敏凝膠溶蝕曲線和釋藥曲線如圖5和圖6所示。結(jié)果表明，其釋放具有時(shí)相性，前期釋藥稍快，后期釋藥則有明顯的緩釋特征，釋放時(shí)間可達(dá)18小時(shí)以上。初步分析防風(fēng)多糖溫敏凝膠體外釋藥特征為緩釋釋放。以累積溶蝕率為橫坐標(biāo)(X)，累積釋放率為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)一步考察凝膠溶蝕與藥物釋放的相關(guān)性，得到其回歸方程Y=0.9592X+1.1145，R2=0.9986。以上結(jié)果表明，藥物釋放與凝膠溶蝕是同時(shí)進(jìn)行的，藥物釋放速率主要受到凝膠溶蝕的控制。

圖5 防風(fēng)多糖溫敏凝膠體外溶蝕曲線(n=3)

圖6 防風(fēng)多糖溫敏凝膠體外釋藥曲線(n=3)

3 討論

經(jīng)皮給藥是指藥物運(yùn)用到皮膚后，通過(guò)角質(zhì)層經(jīng)毛細(xì)血管吸收使該處的藥物濃度升高，達(dá)到并維持有效濃度，具有局部或全身治療作用[13]。中藥經(jīng)皮給藥有多種劑型，乳膏劑、軟膏劑、散劑、涂劑等傳統(tǒng)外用制劑存在載藥量小、生物利用度低、污染衣物等缺陷，且手工制備劑量不精確、工藝粗放，無(wú)法滿足高質(zhì)量中藥制劑的需求[14]。溫敏凝膠在局部給藥方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其可以提高藥物的溶解度及穩(wěn)定性，且直接作用于病變部位，具有緩釋、控釋功能，生物利用度高，患者順應(yīng)性好，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于中藥新劑型開(kāi)發(fā)。本研究采用P407和P188作為凝膠基質(zhì)，制備工藝簡(jiǎn)單、靶向性強(qiáng)，且具有一定的表面活性能增加難溶藥物的溶解度[15]，克服了以殼聚糖為基質(zhì)制備的凝膠膠凝溫度難控制、膠凝時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，而且相較于以N-異丙基丙烯酰胺為基質(zhì)制備的凝膠，對(duì)皮膚無(wú)刺激性。

防風(fēng)多糖是多種生物活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[16]，在防治過(guò)敏疾病方面有潛在的優(yōu)勢(shì)。課題組前期使用二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，通過(guò)耳腫脹率、體質(zhì)量和器官重量等指標(biāo)評(píng)價(jià)防風(fēng)多糖的抗過(guò)敏能力，結(jié)果表明防風(fēng)多糖能有效的抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，具有抗過(guò)敏的作用[17]。然而，中藥成分的添加可能會(huì)影響制劑的穩(wěn)定性。因此，本研究比較2%、4%、6%、8%不同比例的多糖加入對(duì)基質(zhì)膠凝性質(zhì)的影響，2%、4%、6%比例的多糖加入后溶解完全得澄清液體，8%多糖加入后溶液載藥量飽和，有多糖析出。2%、4%、6%多糖加入后膠凝溫度分別為30.5℃、30.8℃、30.7℃，證明多糖的加入對(duì)溫敏凝膠膠凝溫度和性質(zhì)影響較小，所制備的防風(fēng)多糖溫敏凝膠性質(zhì)穩(wěn)定。

防風(fēng)多糖溫敏凝膠用于治療過(guò)敏性疾病，其溶蝕作用與藥物釋放機(jī)制和治療效果息息相關(guān)，通過(guò)研究藥物濃度與消除規(guī)律，可有效評(píng)價(jià)制劑優(yōu)劣和指導(dǎo)用藥。由體外溶蝕曲線和釋藥曲線可知，在初始階段防風(fēng)多糖釋放速率較快，隨著釋放時(shí)間的延長(zhǎng)，防風(fēng)多糖釋放速率逐漸減慢，曲線斜率接近于零，表明防風(fēng)多糖溫敏凝膠藥物釋放達(dá)到平衡。主要原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溫敏凝膠內(nèi)部的防風(fēng)多糖向介質(zhì)中不斷擴(kuò)散，溫敏凝膠表面和藥物介質(zhì)中的藥物濃度梯度逐漸降低，使藥物釋放速率減慢，由此表現(xiàn)出緩釋的效果。

本論文制備的防風(fēng)多糖溫敏凝膠工藝穩(wěn)定，外觀均勻，質(zhì)量可控且有較好緩釋作用，可為臨床治療過(guò)敏性疾病提供新型藥物，為防風(fēng)新劑型的開(kāi)發(fā)提供參考。溫敏凝膠劑作為一種新型的外用制劑，工藝簡(jiǎn)單，工業(yè)化生產(chǎn)較為便利，生物利用度高，患者適應(yīng)性好，適合中藥制劑的應(yīng)用現(xiàn)狀，有利于推廣，可作為中藥傳統(tǒng)制劑劑型改進(jìn)的一種選擇。但凝膠劑載藥量小，仍存在一定的局限性，可應(yīng)用脂質(zhì)體、微囊、微乳、包合物等新技術(shù)使中藥凝膠劑所含藥物發(fā)揮更好的藥效。