廖玉瑤 郭淑娟 周晴 楊翠婷 石艷雙 戴幸星 史新元

冰片屬芳香開竅藥，能引藥由肌表直達(dá)腠理，是目前應(yīng)用較廣泛的中藥揮發(fā)油類促透劑之一[1-3]。根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，冰片有三種基源，包括天然冰片(右旋龍腦)、艾片(左旋龍腦)、合成冰片(合成龍腦)[4]。三者性味歸經(jīng)、功能主治、用法用量相近，因此在臨床用藥上并未嚴(yán)格區(qū)分。由于天然冰片與艾片產(chǎn)量少、成本高，在臨床應(yīng)用上主要以合成冰片為主[5]。但是三種基源冰片的旋光性不同，化學(xué)成分有差異，不同基源的冰片與待促透藥物及角質(zhì)層之間均存在相互選擇，這有可能導(dǎo)致對(duì)藥物促透效果的差異，葉惠嫻等[6]發(fā)現(xiàn)天然冰片較合成冰片對(duì)大黃素的促透效果更強(qiáng)，而陸洋等[7]發(fā)現(xiàn)合成冰片較艾片對(duì)梔子苷的促透效果更強(qiáng)。那么這三者在臨床應(yīng)用上是否可以互為替代品，不加區(qū)別呢？特別是對(duì)于低成本的合成冰片，如果可以相互替代，顯然是減少成本并保護(hù)植物資源的好選擇。因此，研究三種基源冰片對(duì)藥物促透效果的影響，可為冰片的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

藥物分子量(molecular weight，MW)是影響其經(jīng)皮吸收的主要因素之一。有研究認(rèn)為適宜的經(jīng)皮吸收藥物應(yīng)該具有較小的MW、較高的溶解度、較低的熔點(diǎn)以及合適的分配系數(shù)對(duì)數(shù)值(logP值，其在1～3范圍內(nèi)更易于透皮)[8-9]。對(duì)于MW較大的藥物而言，尋找可行的經(jīng)皮促透方法，是經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的一大挑戰(zhàn)。因此，本文選擇兩種logP值一致(logP=1.3)，但MW差異較大的藥物川芎嗪(MW=136)與秋水仙堿(MW=399)為模型藥物，考察三種基源冰片對(duì)其促透效果的差異，為冰片在中藥外用制劑中的合理應(yīng)用提供參考，也為川芎嗪和秋水仙堿經(jīng)皮給藥制劑研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量(200±10)g，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。

1.2 試劑與儀器

天然冰片(批號(hào)：FY24030602)、艾片(批號(hào)：FY2403WG09)、合成冰片(批號(hào)：FY2035GA01)、秋水仙堿(批號(hào)：FY15000715)純度均≥95%，購自南通飛宇生物科技有限公司；川芎嗪(批號(hào)：r03822)純度≥98%，購自百奧百樂生物科技有限公司；乙腈(色譜純，批號(hào)：175157)、甲醇(色譜純，批號(hào)：155759)，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。無水乙醇(分析純，批號(hào)：20170515)，購自北京化工廠；蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；PBS緩沖液(pH = 7.2～7.4，批號(hào)：20171120)，購自北京索萊寶科技有限公司。

高效液相色譜儀(1260，美國安捷倫科技公司)，智能透皮擴(kuò)散儀(TP-6，天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司)，電子天平(BP211D，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 川芎嗪和秋水仙堿含量測定方法的建立

1.3.1 色譜條件 川芎嗪：Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水(40∶60)，流速1 mL/分鐘，檢測波長282 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。秋水仙堿： Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水溶液(45∶55)，流速1 mL/分鐘，檢測波長353 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制 川芎嗪：精密稱取川芎嗪對(duì)照品30.5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并定容，即得濃度為610 μg/mL的川芎嗪對(duì)照品溶液。秋水仙堿：精密稱取秋水仙堿對(duì)照品10.3 mg，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇使溶解并定容，即得濃度為412 μg/mL的秋水仙堿對(duì)照品溶液。

1.3.3 方法專屬性考察 分別取透皮實(shí)驗(yàn)空白接收液、川芎嗪和秋水仙堿對(duì)照品溶液、川芎嗪和秋水仙堿體外透皮實(shí)驗(yàn)接收液，按其色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示接受液中其他成分對(duì)川芎嗪和秋水仙堿的測定無干擾。

1.3.4 線性關(guān)系考察 川芎嗪：精密移取川芎嗪對(duì)照品溶液0.5、1、3、5、8、10 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容至10 mL，得到系列濃度的川芎嗪對(duì)照品溶液，按其色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。川芎嗪對(duì)照品回歸方程為Y= 29.34X+179.89，r= 0.9996，表明川芎嗪在30.05～610.00 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。秋水仙堿：精密移取秋水仙堿對(duì)照品溶液0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容至10 mL，得到系列濃度的秋水仙堿對(duì)照品溶液，按其色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。秋水仙堿對(duì)照品回歸方程為Y=24.57X+6.77，r= 0.9994，表明秋水仙堿在0.41～82.40 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.5 精密度考察 分別取川芎嗪線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度(30.05、305.00、610.00 μg/mL)和秋水仙堿線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度(2.06、41.20、82.40 μg/mL)的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度1日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，按其色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算二者的日內(nèi)精密度；以上樣品連續(xù)3天內(nèi)進(jìn)樣，按其色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算二者的日間精密度。川芎嗪低、中、高三個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為0.13%、0.10%、0.09%，日間精密度分別為0.37%、0.15%、1.39%，均小于2.0%；秋水仙堿低、中、高三個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為0.90%、0.36%、0.15%，日間精密度分別為1.74%、0.67%、0.40%，均小于2.0%。以上結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.3.6 穩(wěn)定性考察 分別取川芎嗪和秋水仙堿體外透皮實(shí)驗(yàn)接收液，分別于0、4、8、12、24、36 小時(shí)進(jìn)樣分析，測得川芎嗪RSD為1.12%，秋水仙堿RSD為1.56%。表明川芎嗪和秋水仙堿體外透皮接收液在36小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

1.4 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

1.4.1 供試品溶液的制備 分別取三種基源冰片和藥物適量，置2 mL容量瓶中，加80%丙二醇溶液適量使溶解并定容，即得含冰片30 mg/mL(3%)和含藥物 30 mg/mL(3%)的供試品溶液。

1.4.2 體外透皮實(shí)驗(yàn) 取雄性SD大鼠處死后，剃除腹部毛發(fā)，剪取腹部正中部位皮膚，去除皮下脂肪組織，用PBS緩沖液清洗干凈，備用。將處理后的大鼠腹部皮膚固定于Franz擴(kuò)散池之間(擴(kuò)散池有效擴(kuò)散面積為3.14 cm2，接收池體積為20 mL)，供給池分別加入2 mL供試品溶液，為使接收池中藥物溶解達(dá)漏槽條件，接收池中選擇含20%乙醇的PBS緩沖液為透皮接收液。溫度設(shè)置為32℃，接收池?cái)嚢柁D(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為300 r/分鐘。分別于0、2、4、6、8、10、12小時(shí)在接收池取樣1 mL，并補(bǔ)充等體積的空白接收液，所得樣品過濾后，采用HPLC測定接收液中藥物的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

藥物的單位面積累計(jì)滲透量Qn，μg/cm2按下式計(jì)算:

其中，Cn和Ci為第n個(gè)和第i個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度，V0為擴(kuò)散池接收室體積(20 mL)，Vi為每次取樣的體積(1 mL)，A為皮膚有效面積(3.14 cm2)。

將Qn與時(shí)間作圖得到藥物經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線，其中直線部分(6～12小時(shí))的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率[J，μg/(cm·h)]，直線部分反向延長線與X軸的交點(diǎn)即為滯后時(shí)間(Tlag，h)。促透效率(ER)按下式計(jì)算:

ER=Je/J0

其中，Je為加入促滲劑之后的穩(wěn)態(tài)透皮數(shù)率，J0為不加促滲劑的穩(wěn)態(tài)透皮速率。

2 結(jié)果

2.1 不同基源冰片對(duì)川芎嗪經(jīng)皮滲透的影響

三種基源冰片對(duì)川芎嗪的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線及相關(guān)滲透參數(shù)見圖1和表1。結(jié)果顯示，對(duì)照組川芎嗪的12小時(shí)累計(jì)滲透量達(dá)到(2004.47±351.82) μg/cm2，川芎嗪由于自身分子量小，具有良好的經(jīng)皮滲透能力。分別加入三種冰片后，川芎嗪的累計(jì)滲透量增加到1～2倍，表明三種基源冰片對(duì)川芎嗪均有明顯的促透作用，但三者促透效果的差異不顯著。同時(shí)，相比于天然冰片與艾片，合成冰片的滯后時(shí)間小于對(duì)照組川芎嗪，表明合成冰片能縮短川芎嗪的起效時(shí)間。綜合促透效率與滯后時(shí)間，三種基源冰片促透的效果排序?yàn)椋汉铣杀?天然冰片>艾片。

注：A 天然冰片；B 艾片；C 合成冰片；D 對(duì)照組。

2.2 不同基源冰片對(duì)秋水仙堿經(jīng)皮滲透的影響

三種基源冰片對(duì)秋水仙堿的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線及相關(guān)滲透參數(shù)見圖2和表2。結(jié)果顯示，對(duì)照組秋水仙堿的12小時(shí)累計(jì)滲透量為(100.15±59.85)μg/cm2，秋水仙堿由于分子量大，自身的透皮能力較差。分別加入三種冰片后，秋水仙堿的累計(jì)滲透量增加到3～6倍，表明三種冰片對(duì)秋水仙堿均有明顯的促透作用，且三者間存在顯著差異。三種冰片的滯后時(shí)間均小于對(duì)照組秋水仙堿，表明其均能縮短秋水仙堿的起效時(shí)間。綜合促透效率與滯后時(shí)間，三種基源冰片促透的效果排序?yàn)椋禾烊槐?合成冰片>艾片。

注：A 天然冰片；B 艾片；C 合成冰片；D 對(duì)照組。

滲透動(dòng)力學(xué)曲線(n=3)

2.3 不同基源冰片對(duì)兩種分子量藥物促透效率的比較

三種基源冰片對(duì)兩種分子量大小藥物的促透效果如表3所示。對(duì)于同一藥物，三種基源冰片的促透效率存在差異，盡管三種冰片對(duì)川芎嗪促透效果的差異并不顯著，但從數(shù)值上可以觀察到對(duì)于兩種藥物而言，天然冰片與合成冰片的促透效果更強(qiáng)。此外，三種基源冰片對(duì)秋水仙堿的促透效率均顯著高于川芎嗪的促透效率，表明三種冰片對(duì)大分子藥物的促透效果更佳。

表3 不同基源冰片對(duì)兩種分子量藥物的促透效率

3 討論

本文研究結(jié)果表明，對(duì)于同一藥物而言，三種基源冰片的促透效果有所差異，其中天然冰片與合成冰片均顯示出較艾片更好的促透效果。不論何種冰片，最主要的功效成份都是龍腦(2-莰醇)，但純度和旋光性有所差別，天然冰片應(yīng)含右旋龍腦96%以上，艾片應(yīng)含左旋龍腦85%以上，合成冰片中消旋龍腦含量應(yīng)在55%以上[10]，這造成了三種基源冰片在透皮吸收、黏膜滲透、體內(nèi)藥效等多方面的差異[11-13]。此外，冰片促透的主要作用部位在皮膚的角質(zhì)層，富含手性物質(zhì)神經(jīng)酰胺[14]。因此，基于三種基源冰片的旋光性與角質(zhì)層神經(jīng)酰胺的手性中心，促透劑與皮膚之間可能存在立體選擇性[15-16]，導(dǎo)致三種冰片的促透效果差異。對(duì)于不同分子量的藥物而言，三種基源冰片對(duì)秋水仙堿的促透效率均大于對(duì)川芎嗪的促透效率，表明冰片對(duì)分子量較大的藥物比對(duì)分子量較小的藥物促透效果更顯著。角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障，其脂質(zhì)排列緊密， 間隙小[17]， 分子量較大的藥物不易穿透角質(zhì)層脂質(zhì)，滲透能力弱。已有研究表明，冰片的促透機(jī)制包括擾亂角質(zhì)層類脂與誘導(dǎo)瞬時(shí)孔等[18]，從而能有效地促進(jìn)大分子量藥物的經(jīng)皮滲透[19]。

表1 不同基源冰片對(duì)川芎嗪的相關(guān)滲透參數(shù)

表2 不同基源冰片對(duì)秋水仙堿的相關(guān)滲透參數(shù)

受資源與成本的限制，目前市場上以合成冰片為主，但有研究認(rèn)為合成冰片在很大程度上效果不及天然冰片[5]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，三種基源冰片均能顯著提高兩種分子量藥物的體外經(jīng)皮滲透率。對(duì)小分子藥物，合成冰片有較好的促透效果；對(duì)于難以透皮吸收大分子藥物，三種冰片均具有高于小分子的促透效果，合成冰片的促透效果雖不及天然冰片，但高于艾片。因此，從來源與成本角度考慮，在以冰片為促透劑的現(xiàn)代中藥外用制劑研發(fā)中，合成冰片是可行的選擇。