馬增斌，邸學(xué)士，袁巧妹，孫悅禮，龍水文，冉 宇，覃昌龍，張 超，李忠澤，鄭志堅，陳 江,7△，王擁軍4,△

(1.北京醫(yī)院，北京 100730；2.國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100730；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；6.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032；7.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

頸椎病是指由多種原因引起的以頸椎間盤退變?yōu)橹?，累及周圍結(jié)構(gòu)、組織發(fā)生病理改變的一種臨床綜合征[1]。近年來，頸椎病的發(fā)病逐漸年輕化，嚴(yán)重威脅著人們的生活健康[2]。頸椎病臨床治療主要包括手術(shù)和非手術(shù)治療兩種方式,非手術(shù)治療包括西藥、中藥、康復(fù)手法、外治等方式。西藥治療以緩解癥狀為主，具有一定不良反應(yīng)及副作用，中藥治療從病因入手，其副作用小且具有明顯優(yōu)勢[3]。

頸椎病屬于中醫(yī)“項痹”“血痹”“項強(qiáng)”“頸肩痛”等范疇，國家中醫(yī)藥管理局將其分為風(fēng)寒濕痹、氣血虧虛、氣滯血瘀、痰濕阻滯、肝腎不足5型[3]。中醫(yī)認(rèn)為肝主筋，脾主肉，腎主骨，該病的發(fā)生發(fā)展與肝脾腎三臟關(guān)系密切，經(jīng)絡(luò)痹阻、氣虛血瘀為其基本病機(jī)[4]。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗5味中藥組成，黃芪為君甘溫益氣，配合桂枝散風(fēng)寒而益氣和血通經(jīng)，配伍白芍合營通痹，佐使姜棗合營衛(wèi)、調(diào)諸藥，5味中藥相配伍益氣活血、活絡(luò)通痹。大量臨床研究證實，黃芪桂枝五物湯治療各類型頸椎病均具有一定療效[5-7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體角度探討黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥化合物獲取及活性成分篩選

以“黃芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大棗”為檢索詞，在TCMSP平臺[8]進(jìn)行檢索，將參數(shù)生物利用度設(shè)置大于或等于30%，類藥性設(shè)置大于或等于0.18，篩選5味中藥的活性成分。

1.2 活性成分靶點預(yù)測

通過TCMSP平臺獲取各中藥成分相關(guān)靶點蛋白，并對蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 頸椎病靶點獲取

將“cervical myelopathy”“cervical spondylosis”“cervical spondylotic radiculopathy”作為檢索詞，分別在疾病靶點數(shù)據(jù)庫篩選相關(guān)靶點。通過ImageGP平臺繪制成分靶點、疾病靶點韋恩圖。

1.4 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，每個節(jié)點所具有的關(guān)系數(shù)量記為度值，度值越高其代表節(jié)點所關(guān)聯(lián)的節(jié)點越多，該節(jié)點重要性就越高。

1.5 蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取交集靶點互相作用關(guān)系(protein-protein interaction，PPI)，通過cytoscape繪制蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO功能及通路富集分析

通過DAVID6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO及通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，通過微生信平臺繪圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分篩選結(jié)果

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選，剔除無對應(yīng)靶標(biāo)及與疾病靶點無交集靶標(biāo)的化合物后，共獲得活性成分41種，其中包括quercetin、beta-sitosterol、kaempferol等化合物(詳見表1)。

表1 黃芪桂枝五物湯中藥活性成分比較

2.2 靶點預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取頸椎病相關(guān)靶點12358個，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黃芪桂枝五物湯中藥靶點227個。通過ImageGP平臺對2組靶點取交集，獲得187個黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的潛在作用靶點(見圖1)。

圖1 “黃芪桂枝五物湯靶標(biāo)基因-頸椎病相關(guān)基因”韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點-疾病“網(wǎng)絡(luò)圖，(見圖2)，該網(wǎng)絡(luò)由235個節(jié)點879條邊組成，其中節(jié)點代表中藥及其活性成分和靶點，邊代表中藥與活性成分、活性成分與靶點的相互關(guān)系(如圖2)。

注：其中綠色節(jié)點代表黃芪桂枝五物湯中藥，紫色、灰色、紅色、青色節(jié)點代表中藥活性成分，藍(lán)色節(jié)點代表交集靶點

2.4 PPI分析

經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫獲取黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點的互相作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.7.1繪制靶點蛋白互相作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)，節(jié)點表示靶點蛋白，邊表示2個蛋白相連，網(wǎng)絡(luò)中共計167個靶點蛋白1292條邊，度值越高節(jié)點越大，在網(wǎng)絡(luò)中所占有的地位越大，其中度值排名的靶點包括AKT1、TP53、JUN、TNF、IL6、CTNNB1、EGFR、CASP3、RELA、VEGFA，推測其在黃芪桂枝五物湯治療頸椎病過程中具有重要地位。

圖3 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

對黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點進(jìn)行GO、KEGG分析。通過bioinformatics平臺對分析結(jié)果進(jìn)行可視化展示(見圖4)。GO分析結(jié)果示，BP相關(guān)條目699條，生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA復(fù)制、藥物反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、凋亡的負(fù)調(diào)控等生物過程。MF相關(guān)條目134條，分子功能主要包括參與蛋白質(zhì)、酶、轉(zhuǎn)錄因子、DNA、ATP等生命物質(zhì)的結(jié)合作用，并影響蛋白質(zhì)異二聚體、轉(zhuǎn)錄因子活性；CC相關(guān)條目46條，靶基因主要與細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體等部位關(guān)系密切。

圖4 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點GO富集分析柱狀圖

KEGG富集分析結(jié)果顯示，共獲取黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點相關(guān)通路130個(圖5)。

圖5 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

頸椎病是一種病程漫長、癥狀復(fù)雜，以頸肩僵硬、疼痛、麻木較為常見，伴或不伴有頭痛、頭暈，嚴(yán)重者可出現(xiàn)四肢無力、走路不穩(wěn)等特點的臨床綜合癥。頸椎病病理機(jī)制復(fù)雜，多由頸椎間盤退行性改變、椎體骨質(zhì)增生、韌帶肥厚鈣化等誘因?qū)е?，并與年齡、生活方式等因素關(guān)系密切[9]。張仲景首次提出“血痹陰陽俱微……黃芪桂枝五物湯主之”。中醫(yī)認(rèn)為頸椎病患者病程漫長，久病則氣血失和，經(jīng)絡(luò)失于濡養(yǎng)，不榮則麻；瘀血、頑痰有形之邪共同阻滯經(jīng)脈，不通則痛[10]。黃芪桂枝五物湯具有益氣活血、活絡(luò)通痹之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，黃芪桂枝五物湯能夠調(diào)節(jié)免疫，降低氧化反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[11-13]。

本研究共篩選出黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的41種活性成分，其中槲皮素是一種天然黃酮類化合物。有研究表明，槲皮素能夠減少髓核細(xì)胞凋亡，防止髓核細(xì)胞外基質(zhì)變性[14]，還可以通過SIRT1-自噬途徑減輕椎間盤退變[15]。此外槲皮素可抑制髓核細(xì)胞中衰老相關(guān)因子的表達(dá)，從而減緩椎間盤退變的進(jìn)展[16]；山柰酚同屬黃酮類化合物，可通過降低細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞活力、增加抗炎細(xì)胞因子水平來減緩椎間盤退變[17]；β-谷甾醇和異鼠李素2種化合物均具有抗炎、抗氧化作用[18-20]，炎性反應(yīng)及過氧化均為椎間盤退變的誘因[21]，筆者推測β-谷甾醇和異鼠李素可能通過上述途徑減緩椎間盤退變。通過PPI靶點網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑢Π悬c按照度值排序，排名越靠前的靶點在黃芪桂枝五物湯治療頸椎病過程中越重要，其中排名靠前的靶點包括AKT1、細(xì)胞腫瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、TNF、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-6、EGFR、CASP3、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。AKT1屬于蘇氨酸蛋白激酶，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長。王云浩等[22]認(rèn)為該蛋白與髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，進(jìn)而影響椎間盤退變；TNF是一種常見的蛋白家族，國外細(xì)胞實驗證實TNF參與髓核細(xì)胞鈣化，從而影響椎間盤退變[23]，其家族成員TNF-α被證實能夠參與炎癥反應(yīng)[24]，并可影響生長因子的表達(dá)[25]，進(jìn)而促使椎間盤退變。此外，TGF-α和EGFR均可促進(jìn)血管組織向髓核內(nèi)生長，加重椎間盤退變[26]。

通過GO富集分析結(jié)果推測，黃芪桂枝五物湯有效成分可能作用于靶點蛋白的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體等部位，并通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA復(fù)制、藥物反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、凋亡的負(fù)調(diào)控等生物過程，參與蛋白質(zhì)、酶、轉(zhuǎn)錄因子、DNA等生命物質(zhì)的結(jié)合作用，并影響蛋白質(zhì)異二聚體、轉(zhuǎn)錄因子活性。KEGG通路富集分析中，PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1、叉頭框蛋白(forkhead box，F(xiàn)OX)O等信號通路富集靶點較多。PI3K-Akt作為一個經(jīng)典的信號通路，國內(nèi)學(xué)者劉福水等[27]發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt通路能介導(dǎo)頸后伸肌細(xì)胞的自噬、凋亡平衡；童秀冰等[28]在1項動物試驗中也發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)可能影響頸椎間盤軟骨細(xì)胞的凋亡水平；此外，該通路已被證實能夠誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞的血管長入，抑制隨髓核細(xì)胞凋亡[29]，促進(jìn)髓核細(xì)胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)[30]。MAPK通路是細(xì)胞信息傳遞的重要通路。國外研究證實，MAPK通路能夠抑制大鼠退行性頸椎間盤模型炎癥反應(yīng)和基質(zhì)變性[31]。國內(nèi)學(xué)者董良杰等[32]發(fā)現(xiàn)，該通路能夠介導(dǎo)血清疼痛介質(zhì)釋放，減輕頸椎病患者疼痛癥狀，并能抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。此外該通路還能促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖[33]，減弱髓核細(xì)胞的凋亡[34]，調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的自噬[14]；NF-κB通路廣泛存在于動物和人體細(xì)胞內(nèi)，能夠參與細(xì)胞對外界刺激的響應(yīng)。何堅等[35]認(rèn)為，NF-κB通路可通過釋放多種炎癥因子減輕頸椎間盤的炎癥損傷。陳會濱等[36]在1項動物試驗研究中發(fā)現(xiàn)，藥物可能通過該通路對神經(jīng)根型頸椎病發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；FOXO是FOXO通路重要組成蛋白，研究證實該蛋白的缺失會促進(jìn)椎間盤的退化[37]。值得一提的是，癌癥信號通路盡管富集靶點較多，但其報道頸椎病相關(guān)甚少，其與頸椎病的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。此外，本研究中PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、HIF-1、FOXO等通路富集靶點較多并參與髓核細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等過程，可能成為今后研究黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的重要方向。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，闡述了黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的活性成分、基因靶點、信號通路之間的相互關(guān)系，為今后黃芪桂枝五物湯治療頸椎病分子層面的深入研究提供參考。