劉莎莎,李紅銳, 孫靜賢，王瑞生，邵金良，劉宏程, 黃相中, 李艷紅

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650504；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205)

流蘇石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，多生長于疏松的厚樹皮或樹干上.目前，野生的流蘇石斛資源非常少，主要依賴人工栽培，是一種深受人們喜愛的觀賞性花卉，主產(chǎn)于云南、貴州、廣東和廣西等地[1].2021年版中國藥典將流蘇石斛收載為中藥石斛的基原藥材之一.流蘇石斛生于樹木之上，為木斛的代表品種[2].南北朝時(shí)期醫(yī)家本草著作在論述中提及木斛不可用，但到明清時(shí)期，將木斛作為石斛使用的現(xiàn)象已非常普遍，說明流蘇石斛作為中藥石斛的基原藥材有其歷史淵源[2].

流蘇石斛含有多種化學(xué)成分，包括多糖[3]、聯(lián)芐類[4]、菲類[5]及甾體[6]等.其中，多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[7].聯(lián)芐類化合物moscatilin對HL-60 、SMMC-7721等多種癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[8]，流蘇菲對人胃癌細(xì)胞有一定的抑制作用[9].前人的研究表明流蘇石斛化學(xué)成分的生物活性比較廣泛.對其開展化學(xué)成分及生物活性的研究，有利于提高對中藥石斛的全面認(rèn)識和推廣.本實(shí)驗(yàn)對流蘇石斛乙醇提取物進(jìn)行分離、純化得到11個(gè)化合物(見圖1).化合物5～11均為首次從該植物中分離得到，部分化合物顯示了一定的體外抗炎和α-葡萄糖苷酶抑制活性.

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 儀器與材料

OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國，上海愛郎博儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國，美國Agilent公司)；AL104電子分析天平(中國，梅特勒-托利多儀器有限公司)；多功能全波長酶標(biāo)儀(中國，賽默飛世爾科技有限公司)；Bruker AV-400 核磁共振儀(瑞士，布魯克公司)；200～300目硅膠(中國，青島海洋化工廠)；Agilent XDB-C18色譜柱(9.4 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(20～150 μm，瑞典，Pharmacia精細(xì)化工有限公司)；RAW264.7巨噬細(xì)胞系(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)；NO檢測試劑盒(中國，上海碧云天生物技術(shù)公司)；阿卡波糖(中國，北京百靈威科技有限公司)；脂多糖、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(中國，sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司)；其余分析純、色譜級試劑(中國，廣東光華科技股份有限公司).

流蘇石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)由劉宏程研究員(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所)鑒定和提供.現(xiàn)將標(biāo)本編號為No.202009DF，并存入云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院標(biāo)本室.

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 提取與分離

流蘇石斛 1.35 kg，粉碎，用95%工業(yè)乙醇提取，減壓濃縮得浸膏 80 g，加100目硅膠拌樣，用石油醚∶乙酸乙酯(95∶5、90∶10、80∶0、70∶30、60∶40、0∶100,V/V)梯度洗脫，經(jīng)硅膠柱層析分離，得到5個(gè)組分(Fr.1～Fr.5).Fr.1用sephadex LH-20分離，以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脫，再以100%甲醇純化，得到化合物7(10.0 mg).Fr.2用sephadex LH-20分離，以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脫，得到化合物8(12.0 mg)，以氯仿∶甲醇重結(jié)晶，得到化合物9(67.1 mg)，以100%甲醇洗脫得到化合物10(16.0 mg)和化合物11(22.0 mg).Fr.3用sephadex LH-20分離，先以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脫，再用甲醇∶水(36∶64,V/V)為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物6(5.1 mg).Fr.4用sephadex LH-20柱分離，以100%甲醇洗脫，得到化合物1(92.1 mg)、化合物2(5.1 mg)及Fr.4a組分.Fr.4a經(jīng)sephadex LH-20柱用石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脫，得到化合物3(12.3 mg).Fr.5以甲醇∶水(56∶44,V/V)為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物4(6.4 mg)，以甲醇∶水(35∶65,V/V)為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物5(6.4 mg).

1.3 抗炎活性篩選

參照文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法，取對數(shù)期細(xì)胞，通過消化重懸及細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為 1×107個(gè)/L，并接種于96孔板，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后，空白組除外其余各組每孔加 50 μL LPS刺激，樣品組加入不同終濃度為100.00、50.00、25.00、12.50和 6.25 μmol/L 的待測化合物 50 μL，陽性對照組給L-NMMA(用藥劑量終濃度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L)每孔 50 μL，各組平行3次，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng) 24 h，取上清液測定NO濃度.具體方法為取 70 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，加入GriessⅠ試劑 50 μL，再加入等量的GriessⅡ試劑，混勻，于波長 540 nm 處測定吸光度.比對標(biāo)準(zhǔn)管得出上清液中的NO含量(μmol/L).利用GraphPadPrism 5軟件處理數(shù)據(jù)得到IC50.

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

采用pNPG法測定化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法，并做調(diào)整.樣品組(A1)以 10 μL 不同濃度的樣品待測液分別加入96孔板中，并與 20 μL 的 0.2 U/mL 葡萄糖苷酶溶液混勻，37 ℃ 恒溫反應(yīng) 5 min 后，各管加入 20 μL 的 2.5 mmol/L PNPG底物，在 37 ℃ 下繼續(xù)恒溫反應(yīng) 15 min，再加入 50 μL 的 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于 405 nm 波長處測定吸光度.以阿卡波糖為陽性對照，空白組(A0)以PBS代替酶液，陰性對照組(A2)以DMSO代替樣品.樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=[A2-(A1-A0)]/A2×100

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末，C15H12O3，不飽和度為10，ESI-MS(m/z): 241[M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)顯示1個(gè)甲氧基質(zhì)子信號δH4.03(3H,s,4-OCH3)，其余均為雙鍵上的質(zhì)子:δH7.55(1H,d,J=8.8 Hz,H-9),7.42(1H,s,H-10),7.40(1H,m,H-7),7.35(1H,dd,J=7.6,1.6 Hz,H-6),7.12(1H,dd,J=7.4,1.8 Hz,H-8),6.98(1H,d,J=2.4 Hz,H-1),6.90(1H,d,J=2.4 Hz,H-3).13C NMR(CD3OD,100 MHz)顯示15個(gè)碳信號:δC157.7(C-4),156.7(C-2),154.9(C-5),137.6(C-10a),135.4(C-8a),129.9(C-7),127.5(C-9),127.2(C-10),121.6(C-8),120.0(C-4b),117.1(C-6),114.3(C-4a),108.2(C-1),103.1(C-3),包括1個(gè)甲氧基δC58.9(4-OCH3).綜合分析以上數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為moscatin.

化合物2白色粉末，C15H16O3，不飽和度為8，EI-MS(m/z): 244[M]+.13C NMR(CD3OD,100 MHz)顯示15個(gè)碳信號:δC162.2(C-5),159.4(C-3),158.3(C-3′),145.5(C-1),130.2(C-5′),120.8(C-6′),116.3(C-4′),114.7(C-1′),113.8(C-2′),109.1(C-6),106.6(C-2),100.0(C-4),55.5(5-OCH3),39.2(C-α),38.8(C-α′),和化合物1的數(shù)據(jù)相似.不同之處在于化合物2出現(xiàn)了2個(gè)亞甲基信號.化合物2比1少2個(gè)不飽和度，在1的已知結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上推測2可能為聯(lián)芐類結(jié)構(gòu).1H NMR(CD3OD,400 MHz)顯示1個(gè)甲氧基δH3.71(3H,s,5-OCH3)、2個(gè)亞甲基δH2.74-2.84(4H,m,H-α,α′)和一系列雙鍵上的質(zhì)子信號δH7.05(1H,dd,J=7.8,15.4 Hz,H-5′),6.66(1H,d,J=7.7 Hz,H-4′),6.63(1H,t,J=1.8 Hz,H-2′),6.60(1H,dd,J=8.0,2.4 Hz,H-6′),6.24(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),6.23(1H,d,J=2.2 Hz,H-6),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-4).綜合以上數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為batatasin Ⅲ.

化合物3白色粉末，C16H18O4，不飽和度為8，ESI-MS(m/z):273[M-H]-.1H NMR(CD3OD,400 MHz)顯示2個(gè)甲氧基δH3.79(3H,s,3′-OCH3),3.71(3H,s,5-OCH3)、2個(gè)亞甲基δH2.71-2.82(4H,m,H-α,α′)和多個(gè)雙鍵上的質(zhì)子信號δH6.70(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.67(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.61(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.24(2H,m,H-2,6),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-4).13C NMR(CD3OD,100 MHz)顯示16個(gè)碳信號:δC162.2(C-5),159.3(C-3),148.7(C-3′),145.6(C-4′),145.6(C-1),134.7(C-1′),121.9(C-6′),116.0(C-5′),113.4(C-2′),109.2(C-2),106.7(C-6),99.9(C-4),56.3(3-OCH3),55.5(3′-OCH3),39.5(C-α),38.4(C-α′)，和化合物2的數(shù)據(jù)非常相似，僅多了1個(gè)甲氧基取代.結(jié)合參考文獻(xiàn)[12]的數(shù)據(jù)分析，鑒定該化合物為石斛酚.

化合物4無色固體，C17H20O5，不飽和度為8，ESI-MS(m/z): 305 [M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)顯示以下質(zhì)子信號:δH6.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-2′),6.67(1H,d,J=1.9 Hz,H-5′),6.61(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.40(2H,s,H-2,6),3.79(6H,s,3-OCH3,5-OCH3),3.62(3H,s,3′-OCH3),2.80(4H,d,H-α,H-α′).13C NMR(CD3OD,100 MHz)顯示17個(gè)碳信號:δC149.0(C-3,5),148.7(C-3′),145.6(C-4′),134.8(C-4),134.8(C-1′),134.0(C-1),122.1(C-6′),116.0(C-5′),113.6(C-2′),107.0(C-2,C-6),56.7(3-OCH3,5-OCH3),56.4(3′-OCH3),39.5(C-α),38.9(C-α′).以上數(shù)據(jù)表明化合物4比3多了1個(gè)甲氧基取代，結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]的數(shù)據(jù)分析，鑒定該化合物為moscatilin.

化合物5黃色粉末，C15H12O5，不飽和度為10，ESI-MS(m/z): 273[M+H]+.1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.31(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.82(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),5.88(1H,d,J=3.5 Hz,H-8),5.88(1H,d,J=3.5 Hz,H-6),5.32(1H,d,J=12.7 Hz,H-2),3.09(1H,dd,J=16.1,13.6 Hz,H-3a),2.66(1H,d,J=17.0 Hz,H-3b);13C NMR(CD3OD,400 MHz)δ:197.7(C-4),168.6(C-7),165.5(C-5),164.9(C-9),159.0(C-4′),131.1(C-1′),103.3(C-10),129.0(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),97.1(C-6),96.3(C-8),80.4(C-2),44.0(C-3).以上數(shù)據(jù)表明化合物5是二氫黃酮類結(jié)構(gòu)，參照文獻(xiàn)[14]的數(shù)據(jù)分析，鑒定該化合物為柚皮素.

化合物6黃色固體，C10H10O3，不飽和度為6，ESI-MS(m/z): 179[M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:9.61(1H,d,J=7.9 Hz,H-9),7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-7),7.28(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.20(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.88(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.67(1H,dd,J=15.7,7.9 Hz,H-8),3.93(3H,s,3-OCH3);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:196.2(C-9)，156.2(C-7),151.7(C-3),149.5(C-4),127.6(C-1),126.7(C-8),125.1(C-6),116.7(C-5),112.2(C-2),56.5(3-OCH3).結(jié)合參考文獻(xiàn)[15]的數(shù)據(jù)分析，將化合物6鑒定為松柏醛.

化合物7白色粉末，C11H10O4，不飽和度為7，ESI-MS(m/z) 229[M+Na]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.91(1H,dd,J=9.5,1.7 Hz,H-4),7.16(1H,d,J=2.4 Hz,H-5),7.00(1H,d,J=2.8 Hz,H-8),6.29(1H,dd,J=9.4,1.0 Hz,H-3),3.95(3H,s,6-OCH3),3.90(3H,s,7-OCH3);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:163.8(C-2),154.8(C-7),151.3(C-9),148.1(C-6),145.9(C-4),113.6(C-5),113.1(C-10),110.0(C-3),101.0(C-8),56.9(6-OCH3),56.9(7-OCH3).結(jié)合參考文獻(xiàn)[16]的數(shù)據(jù)分析，表明化合物7是香豆素類結(jié)構(gòu)，故鑒定該化合物為scoparone.

化合物8白色固體，C7H6O2，不飽和度為5，ESI-MS(m/z): 123[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.84(1H,s,-CHO),7.82(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,H-6),7.00(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,H-5);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:190.7(CHO),161.2(C-4),131.7(C-2),131.7(C-6),128.5(C-1),115.1(C-3),115.1(C-5).上述數(shù)據(jù)表明該化合物為對羥基苯甲醛[17].

化合物9白色粉末，C27H42O3，不飽和度為7，ESI-MS(m/z): 415[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.32(1H,d,J=3.2 Hz,H-6),4.40(1H,dd,J=7.4,14.9 Hz,H-16),3.44～3.50(1H,m,H-26β),3.34(1H,t,J=10.8 Hz,H-26α),1.00(3H,s,CH3-19),0.95(3H,d,J=6.9 Hz,CH3-21),0.76(3H,m,CH3-27),0.75(3H,m,CH3-18).13C NMR(CDCl3,100 MHz)顯示27個(gè)碳信號:δC141.0(C-5),121.4(C-6),109.4(C-22),80.9(C-16),71.7(C-3),66.9(C-26),62.2(C-17),56.5(C-14),50.3(C-9),42.1(C-4),41.7(C-20),40.5(C-13),39.9(C-12),37.2(C-1),36.6(C-10),32.2(C-7),31.9(C-15),31.7(C-8),31.4(C-23),30.4(C-2),30.4(C-25),28.8(C-24),21.1(C-11),19.4(C-19),17.1(C-27),16.4(C-18),14.6(C-21).其中包括4個(gè)甲基和1個(gè)季碳(δC109.4)的特征信號，表明化合物9可能為螺甾烷類結(jié)構(gòu)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[18]的數(shù)據(jù)分析，故鑒定為薯蕷皂素.

化合物10白色粉末，C29H48O2，不飽和度為6，ESI-MS(m/z): 429[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.69(1H,d,J=1.3 Hz,H-6),3.67(1H,m,H-3),1.20(3H,s,19-CH3),0.94(3H,d,J=6.5 Hz,21-CH3),0.84(3H,d,J=0.9 Hz,29-CH3),0.82(3H,d,J=1.5 Hz,26-CH3),0.80(3H,s,27-CH3),0.69(3H,J=6.3 Hz,18-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:202.3(C-7),165.1(C-5),126.2(C-6),70.6(C-3),54.8(C-17),50.2(C-14),50.2(C-9),45.5(C-8),45.5(C-24),43.4(C-13),42.1(C-4),38.9(C-12),38.5(C-10),36.2(C-1),36.1(C-20),34.1(C-22),31.5(C-2),29.2(C-16),29.2(C-25),26.6(C-15),26.3(C-23),23.1(C-28),21.2(C-11),19.8(C-26),19.1(C-27),19.0(C-21),17.3(C-19),12.0(C-18),12.0(C-29).上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]比對基本一致，故該化合物被鑒定為7-酮基-β-谷甾醇.

化合物11白色粉末，C30H48O3，不飽和度為7，ESI-MS(m/z): 456 [M]+.1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ: 5.13(1H,t,J=3.3 Hz,H-12),3.00(1H,m,H-3α),2.10(1H,d,J=11.3 Hz,H-18),0.81(3H,d,J=6.4 Hz,Me),1.04,0.89,0.86,0.81,0.74,0.67(18H,s,Me);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:178.2(C-28),138.3(C-13),124.6(C-12),76.9(C-3),54.7(C-5),52.3(C-18),47.1(C-9),46.9(C-17),41.7(C-14),38.6(C-19),38.5(C-20),38.3(C-8),38.3(C-4),38.2(C-l),36.5(C-10),36.2(C-22),32.6(C-7),30.1(C-21),28.3(C-23),27.4(C-15),27.1(C-2),23.8(C-16),23.2(C-27),22.9(C-11),21.0(C-30),18.0(C-6),17.1(C-29),16.8(C-26),16.0(C-25),15.1(C-24).上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]比對基本一致，故該化合物被鑒定為熊果酸.

抗炎活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陽性對照L-NMMA IC50=(13.15±2.24) μmol/L比較，化合物1、2、3、7對NO生成具有一定的抑制作用，其IC50值分別為(67.50±4.73)、(65.86±5.31)、(39.82±3.48、81)和(41±5.67)μmol/L.

α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與阿卡波糖IC50=(298.45±6.92)μmol/L比較，化合物2、3、5、9具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50分別為(288.81±5.98)、(363.21±7.82)、(118.24±6.37)和(377.42±9.35)μmol/L.

3 結(jié)語

從流蘇石斛乙醇提取物中共分離得到11個(gè)化合物，結(jié)構(gòu)類型涉及菲類、聯(lián)芐類、甾體類、三萜類等，化合物5～11均為首次從該植物中分離得到.所有化合物中屬化合物1和9的含量最高，應(yīng)為主要化學(xué)成分。流蘇石斛中具有抗炎和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物主要集中在化合物1～3(聯(lián)芐類結(jié)構(gòu))，說明聯(lián)芐類化合物可能是其主要的活性成分，以期該研究結(jié)果為流蘇石斛活性成分的進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究提供部分借鑒.