王佳雯 朱君

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是人類常見(jiàn)的皮膚腫瘤，約占所有非黑素細(xì)胞皮膚癌的20%[1]，在老年人中更常見(jiàn)，多發(fā)生在頭面部、外陰和外生殖器區(qū)域，治療以手術(shù)切除、激光、冷凍和放療為主[2]。SN38是伊立替康的活性代謝物，其類似的藥效機(jī)制與5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑相似，均可以引起DNA損傷的反應(yīng)，被認(rèn)為是決定細(xì)胞死亡或存活的結(jié)果[3-5]。壞死和凋亡是細(xì)胞死亡的兩種主要形式，壞死在傳統(tǒng)意義上通常被認(rèn)為是一個(gè)“非程序性”的細(xì)胞死亡過(guò)程，但最近研究發(fā)現(xiàn)它也可以通過(guò)一種稱為壞死或程序性壞死的機(jī)制發(fā)生[6]。與細(xì)胞凋亡不同，壞死不是由胱門蛋白酶介導(dǎo)的，但可以被RIP1的特異性小分子抑制劑Necrostatin-1（NEC-1）抑制，通過(guò)作用于蛋白絲氨酸（RIP1）和蘇氨酸激酶（RIP3）的激酶部分，引發(fā)RIP1激酶的二聚化，抑制激酶活性，阻斷RIP1和 RIP3的相互磷酸化。壞死可由活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞因子、烷基化DNA損傷或照射觸發(fā)，并通過(guò)獨(dú)特的信號(hào)通路受體相互作用RIP1/RIP3執(zhí)行[7-8]，在與腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的壞死中，聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）也可作為RIP1/RIP3的下游效應(yīng)因子。越來(lái)越多的證據(jù)表明，壞死調(diào)節(jié)因子的遺傳或表觀遺傳調(diào)控發(fā)生在癌癥中，并與患者的臨床結(jié)果相關(guān)[8]。該研究旨在探討伊立替康活性代謝物SN38對(duì)CSCC細(xì)胞A431壞死性凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人CSCC細(xì)胞A431購(gòu)自南京科陌生物科技有限公司，采用RMPI-1640培養(yǎng)液和10% 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A431細(xì)胞使用6孔

板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)將shRIP3或shRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞（System Biosciences，CA，美國(guó)）：（1）將A431細(xì)胞用胰酶消化，以1,000 r/min離心5 min，洗滌后采用RMPI-1640培養(yǎng)液重懸，置于24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，每孔5×104個(gè)；（2）將shRIP3或shRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h后收集假病毒顆粒；（3）用聚烯（8μg/mL）存在下的假病毒顆粒感染A431細(xì)胞，用嘌呤霉素選擇48 h以穩(wěn)定shRIP3或shRNA表達(dá)。通過(guò)RT-PCR法證實(shí)了RIP3基因的敲低。用免疫熒光檢測(cè)shRIP3轉(zhuǎn)染效率。

1.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用噻唑藍(lán)比色法測(cè)定人CSCC細(xì)胞增殖能力。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞使用96 孔板進(jìn)行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預(yù)，隨后連續(xù)4 d每天每孔加入16μL MTT（5 mg/mL），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h棄去上清液，添加150μL二甲亞砜溶解沉淀，常溫?fù)u床放置20 min，最后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔480 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞使用6 孔板進(jìn)行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預(yù)。待干預(yù)48 h后，參照 AnnexinV FITC試劑盒（BD，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)處理各組細(xì)胞，隨后采用流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞使用6孔板進(jìn)行鋪板，隨后分別使用伊立替康和伊立替康加NEC-1干預(yù)。待干預(yù)48 h 后，將收集好的細(xì)胞參照RIPA裂解液說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，定量、變性，制備凝膠，每孔上樣量40 μg，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，抗RIP抗體（1∶1,000）（Abcam，美國(guó)），抗RIP3抗體（1∶1,000）（Abcam，美國(guó)）及抗GAPDH抗體（1∶2,000），4 ℃孵育過(guò)夜，第2天使用相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，掃描結(jié)果保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞增殖的影響 SN38組A431細(xì)胞增殖率低于正常對(duì)照組，而SN38+NEC-1組A431細(xì)胞增殖率高于SN38組，但仍較正常對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可以抑制A431細(xì)胞增殖，使用RIP1的特異性小分子抑制劑NEC-1干預(yù)后可降低A431細(xì)胞對(duì)SN38的敏感性，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增加。見(jiàn)圖1。

圖1 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞增殖的影響

2.2 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞凋亡水平的影響 正常對(duì)照組A431細(xì)胞凋亡率為（4.02±0.04）%，SN38組A431細(xì)胞的凋亡率為（19.00±2.06）%，而SN38+NEC-1組A431細(xì)胞凋亡率為（11.37±1.67）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可以促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡，使用RIP1的特異性小分子抑制劑NEC-1干預(yù)后可降低SN38對(duì)A431細(xì)胞的凋亡水平。見(jiàn)圖2。

圖2 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞凋亡水平的影響

2.3 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡蛋白水平影響 SN38組RIP1/RIP3蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加，SN38+NEC-1組RIP1/RIP3蛋白表達(dá)量較SN38組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖3。

圖3 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡蛋白水平的影響

2.4 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡下游效應(yīng)蛋白的影響 SN38組PARP-1蛋白較正常對(duì)照組明顯增高，SN38+NEC-1組PARP-1蛋白較SN38組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可影響PARP-1蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖4。

圖4 NEC-1對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡下游效應(yīng)因子的影響

2.5 轉(zhuǎn)染shRNA和shRIP3效率的免疫熒光檢測(cè) 空白對(duì)照組未見(jiàn)到熒光染色，SN38+shRNA組（空載體組）可以見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)免疫熒光，SN38+shRIP3組細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)免疫熒光。見(jiàn)圖5。

圖5 shRNA和shRIP3轉(zhuǎn)染效率的免疫熒光（×40）

2.6 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡蛋白水平的影響 SN38+shRIP3組RIP1/RIP3蛋白表達(dá)量較SN38組明顯降低，而SN38+shRNA組與SN38組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖6。

圖6 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡蛋白水平的影響

2.7 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞凋亡水平的影響 正常對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（0.23±0.03）%，SN38組A431細(xì)胞的凋亡率為（11.60±2.52）%，而SN38+shRIP3組A431細(xì)胞凋亡率為（5.58±0.85）%，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SN38可特異性影響RIP1/RIP3蛋白表達(dá)水平促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖7。

圖7 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞凋亡水平的影響

2.8 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡下游效應(yīng)蛋白的影響 SN38組PARP-1蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增高，SN38+shRIP3組PARP-1蛋白較SN38組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖8。提示SN38可影響PARP-1蛋白表達(dá)水平。

圖8 shRIP3對(duì)SN38干預(yù)A431細(xì)胞壞死性凋亡下游效應(yīng)蛋白的影響

3 討論

CSCC是一種起源于角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚癌，具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能[11]。年齡、種族、暴露于紫外線輻射、陽(yáng)光敏感的皮膚和免疫抑制是CSCC的典型危險(xiǎn)因素[12]。在大多數(shù)情況下，非轉(zhuǎn)移性CSCC可以通過(guò)手術(shù)切除來(lái)治愈。然而，轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性、不可切除的CSCC病例仍需要新的治療策略和藥物。

SN38是伊立替康的活性代謝物，是一種廣泛應(yīng)用的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，通過(guò)促進(jìn)壞死的進(jìn)展，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)DNA損傷積累，并且這種損傷所導(dǎo)致的TNF/TNFR信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞毒性使SN38誘導(dǎo)的RIP1激活和壞死對(duì)結(jié)直腸癌有治療作用[13]。目前，對(duì)伊立替康耐藥或敏感性的基礎(chǔ)仍未明確，因此有必要確定識(shí)別易感患者和逆轉(zhuǎn)耐藥的策略[14-16]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，這種耐藥性可能與代謝改變有關(guān)，包括ATP檸檬酸裂解酶的上調(diào)、AKT通路的激活[15]、p38MAPK通路的上調(diào)[16]和腫瘤缺氧[17]，使用各種信號(hào)抑制劑的試驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究發(fā)現(xiàn)，SN38干預(yù)的A431細(xì)胞增殖能力下降，凋亡水平增高，可能是與SN38誘導(dǎo)的RIP1/RIP3信號(hào)通路激活有關(guān)，聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）作為RIP/RIP3的下游效應(yīng)因子也隨之被激活。

壞死是一種具有壞死形態(tài)的程序性細(xì)胞死亡，發(fā)生在多種生物過(guò)程中，包括炎癥、免疫反應(yīng)、胚胎發(fā)育和代謝異常。目前，普遍將壞死定義為由受體相互作用的RIP1/RIP3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，大量研究強(qiáng)調(diào)了RIP1/RIP3在癌癥中的作用[18]。CHEN等[17]研究發(fā)現(xiàn)，壞死是應(yīng)對(duì)嚴(yán)重應(yīng)激和阻斷細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞殺傷機(jī)制，并提出它可以作為一種替代的細(xì)胞死亡方案來(lái)預(yù)防癌癥。既往研究表明，RIP3表達(dá)的增加與癌癥的發(fā)展相關(guān)，包括結(jié)腸癌、肺癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用壞死性凋亡抑制劑或者基因沉默RIP3（shRNA RIP3）可使A431細(xì)胞對(duì)伊立替康耐藥性增加，說(shuō)明在一定程度上A431細(xì)胞對(duì)伊立替康的耐藥性是由于抑制壞死性凋亡實(shí)現(xiàn)的，激活壞死性凋亡信號(hào)通路可能增加A431細(xì)胞對(duì)伊立替康化療的敏感性。

綜上所述，伊立替康活性代謝物SN38對(duì)可抑制A431細(xì)胞增殖，使其凋亡水平增加，可能是由SN38誘導(dǎo)RIP1/RIP3/PARP-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，而當(dāng)壞死性凋亡信號(hào)通路受到抑制時(shí)，A431細(xì)胞對(duì)SN38的敏感性降低，使其耐藥性增強(qiáng)。因此，激活壞死性凋亡信號(hào)通路可能是治療CSCC的潛在靶點(diǎn)，為臨床上CSCC的耐藥提供了新的治療思路。