王金樂 朱星蓉 夏愛丹 林銀鳳 陳斌斌 孫宏迪 謝炳壽

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，全球近半數(shù)胃癌新發(fā)及死亡病例均發(fā)生在中國[1]，胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要因素之一，術(shù)后復(fù)發(fā)率＞50%，其中大部分是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[2]。Wnt/β-cantenin信號通路的異常活化是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，其參與胃癌細(xì)胞的周期調(diào)控、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelia1-mesenchymal transition，EMT）等多個過程，并在一定程度上決定胃癌患者的預(yù)后[3-4]，以DKN-01、IWP-2、Rspo3為靶點(diǎn)的靶向藥物仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段。京尼平苷（geniposide，GEN）是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等多種藥理活性[5-6]，在口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞中顯示出抗腫瘤作用[7]，還可以通過改變凋亡相關(guān)因子Bcl-2及Bax的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡[8]。GEN在體外和體內(nèi)均顯示出對幽門螺桿菌感染的抑制作用[9]，但國內(nèi)外關(guān)于GEN作用于胃癌的研究報道并不多見。該研究通過體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞，探討GEN對SGC-7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。（2）主要試劑：胎牛血清購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海凌峰化學(xué)試劑公司；乙醇購自上海吉諾試劑公司；RPMI-1640液體培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；NaCl和KC1購自上海生工生物股份有限公司；Na2HPO4和KH2PO4購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LiCl購自美國Merck公司；Fibronectin（F8180）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁生物；4%多聚甲醛購自上海博谷生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶消化液和結(jié)晶紫染色液購購自上海碧云天科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（354234）購自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和q-PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔單克隆抗體β-catenin（8480S）、鼠單克隆抗體E-cadherin（14472）、兔單克隆抗體Snail（3879S）、兔單克隆抗體Vimentin（5741）和兔單克隆抗體GAPDH（2118）購自美國CST公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（A0208）和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（A0216）購自上海碧云天科技有限公司；HRP化學(xué)發(fā)光底物購自美國Miliipore公司。（3）主要儀器：電子分析天平購自德國賽多利斯公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；細(xì)胞計數(shù)儀、多功能酶標(biāo)儀、垂直電泳儀、Western濕轉(zhuǎn)儀購自美國BIO-RAD公司；Transwell小室購自美國corning公司；StepOne Plus實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；PCR擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司；小離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；二氧化碳孵箱購自美國Thermo公司；倒置光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；熒光顯微鏡購自奧林帕斯（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：在含10% FBS和1% 青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度、37 ℃、95%空氣、5% CO2的培養(yǎng)箱。（2）CCK-8法測定GEN對SGC-7901細(xì)胞增殖的作用：取SGC-7901細(xì)胞接種細(xì)胞于96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞；次日配制含0、50、100、200、400、600、800、1,000、1,200、1,400 μM GEN的RPMI-1640培養(yǎng)基，取100 μL上述培養(yǎng)基加入96孔板細(xì)胞中，每組接種3個復(fù)孔，置于37℃、5% CO2的孵箱中分別培養(yǎng)24、48 h；然后，將96孔板中的含GEN培養(yǎng)基更換為含10% CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，最后測定吸光度。（3） Transwell測定GEN對SGC-7901細(xì)胞遷移的作用：分別用含低、中、高劑量GEN的培養(yǎng)基，將濃度為2.0×106個/mL的細(xì)胞150μL加入Transwell上室，并在下室加入含纖連蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，之后取出小室，并拭去上層細(xì)胞后，加入甲醇固定15 min，然后加入結(jié)晶紫染色30 min，洗去染色液后干燥。（4）Transwell測定GEN對SGC-7901細(xì)胞侵襲的作用：取 50μL預(yù)冷的基質(zhì)膠稀釋液（基質(zhì)膠：培養(yǎng)基=1∶2）加入Transwell上室，置于超凈臺內(nèi)過夜風(fēng)干，其余步驟同前。（5）蛋白印跡法測定β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達(dá)：分組處理后，進(jìn)行蛋白印跡法，其中抗體配比如下，β-catenin（1∶1,000）、E-cadherin（1∶500）、Snail（1∶500）和Vimentin（1∶500）。（6）實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表達(dá)：分組處理后，采用TRIZOL法提取SGC-7901細(xì)胞總RNA，將基因組DNA去除后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用SYBR Green 法將得到的cDNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)。采用2（-△△CT）法計算β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成：GAPDH，5- GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA -3（forward） and 5- CCAAATTCGTTGTCATACCAG -3（reverse）；E-cadherin，5- CGAGAGCTACACGTTCACGG -3（forward） and 5- GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG -3（reverse）；Vimentin，5- AGTCCACTGAGTACCGGAGAC -3（forward） and 5- CATTTCACGCATCTGGCGTTC -3（reverse）；Snail，5- CAATCGGAAGCCTAACTA -3（forward） and 5- CAGATGAGCATTGGCAGCG -3（reverse）。（7）LiCl和GEN共處理SGC-7901細(xì)胞：分別設(shè)置空白組、GEN（80μM）組、LiCl（5μM） 與GEN共處理組，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，采用蛋白印跡法檢測蛋白表達(dá)，利用q-PCR技術(shù)檢測mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)得到GEN作用24 h對SGC-7901細(xì)胞的IC10=（165.14±10.93）μM，見圖1A；作用48 h對SGC-7901細(xì)胞IC10=（201.00±19.45）μM，見圖1B；選取40、80、160μM作為觀察GEN抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的低、中、高劑量。

圖1 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

2.2 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞株遷移和侵襲功能的影響 GEN作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，對照組和低、中、高劑量組穿過Transwell小室的SGC-7901細(xì)胞數(shù)分別為550個、431個、280個、145個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A和 2B。GEN作用胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，各組穿過基質(zhì)膠和小室膜的SGC-7901細(xì)胞數(shù)分別為387個、261個、139個、69個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2A和2C。

圖2 GEN抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲

2.3 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞EMT的作用 結(jié)果顯示，低、中、高劑量組的E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。GEN低、中、高劑量組的Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)明顯受抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3～4。

2.4 GEN抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞Wnt/β-cantenin信號通路 與對照組比較，GEN低、中、高劑量組β-cantenin和Snail的蛋白及mRNA表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3～4。

圖3 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達(dá)的作用

2.5 GEN通過Wnt/β-cantenin信號通路抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲 給予Wnt激活劑LiCl后再給予GEN（80μM），與干預(yù)正常SGC-7901胃癌細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)GEN抑制其遷移和侵襲的能力減弱（P＜0.01）。與干預(yù)正常SGC-7901胃癌細(xì)胞組比較，LiCl與GEN聯(lián)合處理組細(xì)胞的E-cadherin的蛋白及mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.01）；β-catenin、Snail和Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），見圖5～7。

圖4 GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表達(dá)的作用

圖5 GEN與LiCl聯(lián)合處理對胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖6 GEN與LiCl聯(lián)合處理對SGC-7901細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

圖7 GEN與LiCl聯(lián)合處理對SGC-7901細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表達(dá)的影響

3 討論

胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第一步需要完成上皮細(xì)胞-間充質(zhì)-轉(zhuǎn)換（EMT），即上皮細(xì)胞失去胞間的連接性，獲得了向遠(yuǎn)處遷移和侵襲能力。EMT過程中最主要的表現(xiàn)為鈣黏著蛋白由上皮型（E-cadherin）向神經(jīng)元型轉(zhuǎn)化，會出現(xiàn)E-鈣黏著蛋白的表達(dá)量減少，而角蛋白骨架則逐漸向波形蛋白（Vimentin）轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致波形蛋白的表達(dá)量增多[10]。Snail是誘導(dǎo)EMT過程中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，能通過多種途徑調(diào)節(jié)EMT過程[11-12]。Wnt/β-catenin信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，β-catenin是該通路的關(guān)鍵蛋白，有研究顯示β-catenin能夠激活Snail蛋白的合成，進(jìn)而影響腫瘤的遷移和侵襲[13]。

京尼平苷是一種環(huán)烯醚萜類化合物，是中藥梔子和杜仲的主要有效成分，具有護(hù)肝利膽、鎮(zhèn)痛降糖、增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力等作用，以梔子和杜仲為主藥的方劑已被證實(shí)具有良好抗腫瘤作用[14-15]。陰虛痰凝是胃癌發(fā)生的主要病機(jī)，而杜仲的功效以補(bǔ)腎滋陰為主，梔子以清利痰濕為主，與胃癌的病機(jī)相對應(yīng)[16-17]?；A(chǔ)研究，顯示，京尼平苷能夠抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞[7]、宮頸癌HeLa細(xì)胞[8]以及胃癌MKN45細(xì)胞[18]的增殖，但其對于胃癌轉(zhuǎn)移的作用，還未見相關(guān)報道。

該研究通過CCK8法測定GEN對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，確定其IC10值，為排除GEN對胃癌細(xì)胞增殖的影響，確定40、80、160μM為GEN測定遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)劑量，結(jié)果顯示GEN在體外能夠抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲。GEN處理細(xì)胞后，通過Westernblot和q-PCR發(fā)現(xiàn)GEN能夠促進(jìn)E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)，抑制Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)，表明GEN是通過抑制EMT過程抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)GEN能夠抑制EMT上游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail和Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)，而β-catenin能夠促進(jìn)Snail的表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為GEN可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲。通過用Wnt激活劑LiCl與GEN共處理胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能降低GEN抑制SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的作用，并拮抗GEN誘導(dǎo)的β-catenin和Snail表達(dá)下降能力，并導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)升高。

綜上所述，GEN能夠在體外抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移與侵襲，其機(jī)制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路抑制EMT過程而實(shí)現(xiàn)的。但該研究僅通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)GEN抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果與機(jī)制，其在體外抑制胃癌轉(zhuǎn)移的效果以及如何抑制Wnt/β-catenin通路，均有待進(jìn)一步深入探究，以期為臨床治療胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新思路。