劉海濤 戚維波 楊帆 陸超 牛牛

肉瘤（sarcoma）是來源于間葉組織的惡性腫瘤，常發(fā)生于皮膚、皮下、骨膜及長骨兩端，好發(fā)于成年人，主要有軟組織肉瘤和骨肉瘤兩種類型[1]。軟組織肉瘤有50多種亞型，最常見的是多形性未分化肉瘤，其次是脂肪肉瘤（25%～30%）、平滑肌肉瘤（12%）、滑膜肉瘤（10%）等[2]。肉瘤的治療以化療應(yīng)用最為廣泛，但30%～50%的患者最終因肺轉(zhuǎn)移而死亡，5年總生存率＜10%，且預(yù)后差[3]。靶向治療是近年來出現(xiàn)的一種新的腫瘤治療策略，通過阻斷腫瘤血管生成來抑制腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[4]。因此，探索潛在的新藥物靶標(biāo)聯(lián)合化療制定個體化治療方案以改善患者預(yù)后具有重要意義。該研究通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫，基于生物信息學(xué)分析EXT1在肉瘤患者中的表達(dá)水平，闡明EXT1在人類肉瘤中的不同表達(dá)模式、潛在功能機制和預(yù)后價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料 GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）是一個公共功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，包含高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)、芯片和微陣列。EXT1表達(dá)水平從GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE2719數(shù)據(jù)集（Affymetrix GPL96 platform，Affymetrix Human Genome U133A Array）下載。根據(jù)平臺上的注釋信息，將探針轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的基因符號。GSE2719數(shù)據(jù)集包含39個人類肉瘤樣本（GSM 52571-GSM52609）和15個對照樣本（GSM52556-GSM52570）。

1.2 CCLE數(shù)據(jù)庫分析 癌癥細(xì)胞系百科全書（cancer cell line encyclopedia，CCLE）（https：//portals.broadinstitute.org/ccle）[5]整合了來自大約1,100個人類癌細(xì)胞系的基因表達(dá)，染色體拷貝數(shù)和大規(guī)模平行數(shù)據(jù)，以及24種抗癌藥物在50%這些細(xì)胞系中的藥理概況。CCLE數(shù)據(jù)集驗證了EXT1在各癌細(xì)胞系中的表達(dá)。

1.3 實驗材料 高糖培養(yǎng)基DMEM購自Hyclone公司，DPBS（PBS粉劑）不含鈣鎂購自Boster公司，10%胎牛血清（FBS）、含EDTA 0.25%胰蛋白酶均購自Gibco公司，SYBR Premix EX Taq II、Prime ScriPt RT Master Mix均購自Takara公司，DMSO（細(xì)胞培養(yǎng)級別）購自MP Biomedicals 公司，β-actin/EXT1引物購自安徽通用生物公司，細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素、PVDF膜（0.2uM）、QuickBlockTMWestern一抗二抗稀釋液、Western轉(zhuǎn)膜液、Western電泳液、QuickBlockTMWestern封閉液、Western洗滌液、Western一抗二抗去除液（弱堿性）均購自碧云天公司，EXT1一抗購自Abcam公司，二抗：HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Servicebio公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人類肉瘤細(xì)胞系（MG-63骨肉瘤、RD橫紋肌肉瘤、HT1080纖維肉瘤）和相應(yīng)的正常細(xì)胞（hFOB1.19人類成骨細(xì)胞細(xì)胞、HSMC人類骨骼肌細(xì)胞、WI38人類成纖維細(xì)胞）均購自賽百慷（上海）生物科學(xué)公司。所有的細(xì)胞系培養(yǎng)含4.5 g/L葡萄糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco BRL，USA）含10%胎牛血清（FBS，Gibco BRL，USA）和1%的抗生素。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR 使用Trizol試劑（Sangon Biotech，China）按照說明書從細(xì)胞中提取總RNA。2021年1月，于深圳市瑞科生物科技有限公司實驗室將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，China）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用Takara Bio’s SYBR Premix Ex TaqTM II在Bio - rad CFX96 real-time PCR系統(tǒng)中進(jìn)行實時定量PCR。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)內(nèi)參校正各個樣本，計算△Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)量[6]。采用以下引物：β-actin正向引物5'-AAC AGGGTGGTGGACCTCAT-3'，反向 引 物5'-GGAGGGGAGATTCAGTGTGG-3'；EXT1正向引物GCTCTTGTCTCGCCCTTTTGT；反向引物GTGGTGCAAGCCATTCCTAC。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 以anti-EXT1（A-7）（Santa Cruz，USA，1∶2,000）、anti-Actin（Santa Cruz，USA，1∶4,000）作為一抗。以1∶3,000～1∶5,000比例稀釋的HRP-linked anti-IgG（Santa Cruz）作為二抗。選取β-actin為內(nèi)參蛋白。采用ECL化學(xué)發(fā)光自顯影，利用Image J軟件將目的條帶灰度數(shù)值化，并與內(nèi)參的灰度值作歸一化處理，制作直方圖。

1.7 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）使用TCGA RNA-seq和來自31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)，對TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析[7]。使用該數(shù)據(jù)庫對EXT1表達(dá)情況與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.8 Kaplan-Meier plottor數(shù)據(jù)庫分析 Kaplan-Meier plotter（http：//www.kmplot.com）分析了肉瘤患者（n=259）的總生存期（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）?；颊邩颖靖鶕?jù)基因的中位表達(dá)（高表達(dá)vs.低表達(dá)）分為兩組，計算95%置信區(qū)間和對數(shù)等級P值的危險比（HR），并在圖上顯示。1.9 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫 LinkedOmics（http：//www.linkedomics.orglogin.php）包含了來自TCGA的32種癌癥的多組數(shù)據(jù)[8]。使用LinkedOmics的LinkFinder模塊研究TCGA肉瘤隊列中與EXT1相關(guān)的差異表達(dá)基因（n=259）。EXT1共表達(dá)采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并在火山圖、熱圖或散點圖中呈現(xiàn)。

1.10 GeneMANIA GeneMANIA（http：//www.genemania.org）是用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）的網(wǎng)絡(luò)，闡明基因和數(shù)據(jù)集之間的關(guān)系[9]。該研究使用GeneMANIA從物理相互作用、共表達(dá)、預(yù)測、共定位和遺傳相互作用等方面可視化EXT1的基因網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行功能評估。

1.11 String和DAVID數(shù)據(jù)庫 String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）（11.0版）是分析生物學(xué)基因或蛋白相互作用的檢索工具，包含已證實以及可預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源[10]。打開數(shù)據(jù)庫輸入多個差異基因，物種類型選擇人類，構(gòu)建靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一個用于注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)的在線數(shù)據(jù)庫，是了解多基因背后生物學(xué)意義的綜合性工具[11]。使用DAVID中的基因本體論（gene ontology，GO）和《京都基因與基因組百科全書》（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行功能和通路富集分析。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism（version 6.01）軟件（GraphPad software，Inc.，La Jolla，CA，USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)≥3次，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉瘤患者EXT1的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫GSE2719數(shù)據(jù)集，EXT1 mRNA在人類肉瘤組織中表達(dá)水平為（7.696±0.153），高于癌旁組織的（5.580±0.255）（P＜0.001，95% CI：1.529～2.704），見圖1A。進(jìn)一步將肉瘤患者中EXT1表達(dá)水平繪制 ROC 曲線并計算曲線下面積（AUC）值，結(jié)果顯示EXT1的AUC值（P＜0.001，AUC=0.9350，95% CI：0.873～0.997）對人類肉瘤具有較高的診斷價值，見圖1B。

圖1 EXT1基因在人類肉瘤中的表達(dá)水平及其診斷價值（GEO）

2.2 EXT1在人類不同類型腫瘤和各腫瘤細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄水平 利用UALCAN和CCLE數(shù)據(jù)庫，EXT1在人類多種腫瘤和各腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。在一組人類癌癥中，EXT1在人類肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，尤其是軟骨肉瘤、骨肉瘤和尤文肉瘤。見圖2和圖3。

圖2 EXT1在人類不同類型腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平（UALCAN）

圖3 EXT1在人類各種類型腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平（CCLE）

2.3 EXT1在人類肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá) 為驗證基于微陣列數(shù)據(jù)集分析的結(jié)果，分別采用qRT-PCR和Western Blot方法檢測了3個人類肉瘤細(xì)胞系（MG-63、RD、HT1080）及其對應(yīng)的正常細(xì)胞（hFOB1.19、HSMC、WI38）中EXT1基因mRNA和蛋白表達(dá)情況（圖4A-4B），結(jié)果證實EXT1在人類肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞（P＜0.05），見圖4C。

圖4 EXT1在人類肉瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平

2.4 EXT1表達(dá)水平與人類肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 使用UALCAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗證TCGA中260個人類肉瘤樣本中EXT1表達(dá)水平與多種臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，EXT1的轉(zhuǎn)錄水平與種族、年齡及TP53突變狀態(tài)顯著相關(guān)（P＜0.05），與性別無關(guān)。見圖5和表1。

表1 EXT1的表達(dá)水平與肉瘤患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

表1 （續(xù)）

圖5 EXT1 mRNA表達(dá)與肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系（UALCAN）

2.5 EXT1在人類肉瘤中的預(yù)后評估價值 使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫在線數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存情況，高表達(dá)的EXT1在OS和PFS均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P=0.016），見圖6。因此，EXT1的高表達(dá)可作為人類肉瘤患者預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。

圖6 高表達(dá)的EXT1在人類肉瘤患者中的預(yù)后評估

2.6 EXT1在人類肉瘤中的共表達(dá)基因及網(wǎng)絡(luò)分析 利用LinkedOmics的功能模塊對259例TCGA 肉瘤患者的mRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Pearson相關(guān)檢驗分析EXT1與在人類肉瘤中差異表達(dá)的基因之間的相關(guān)性，有3,246個基因（暗紅點）與EXT1呈顯著正相關(guān)，有3,408個基因（暗綠點）與EXT1呈顯著負(fù)相關(guān)（[FDR] ＜0.01），見圖7A。分別選取前50個與EXT1正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的共表達(dá)基因繪制熱圖，見圖7B。結(jié)果表明，這些基因在人類肉瘤中具有重要研究價值，其在人類肉瘤中的生物學(xué)功能和分子機制有待進(jìn)一步探索。

圖7 肉瘤患者中與EXT1相關(guān)的共表達(dá)基因

2.7 EXT1及其共表達(dá)基因分析和PPI網(wǎng)絡(luò) 進(jìn)一步預(yù)測EXT1與人類肉瘤共表達(dá)基因的相互作用，利用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，見圖8A。該網(wǎng)絡(luò)中共表達(dá)最顯著的9個基因為EXT2、EXTL1、EXTL2、CPT1A、EXTL3、ANXA5、B4GALT1、B4GALT4和OSTF1。結(jié)果表明，該模塊的基因主要富集于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖生物合成過程、糖胺聚糖生物合成過程和氨基聚糖生物合成過程。通過String對人類肉瘤中與EXT1相關(guān)的50個基因構(gòu)建了蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖8B.

圖8 EXT1的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.8 EXT1及其共表達(dá)基因的功能富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫中的GO和KEGG對共表達(dá)基因的功能和通路富集分析。GO富集分析表明，生物過程（biological process，BP）主要是由糖胺聚糖生物合成過程、細(xì)胞分化、硫酸肝素蛋白聚糖代謝過程、細(xì)胞遷移、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的移動、細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝過程引起的。分子功能（molecular function，MF）主要集中在層粘連蛋白結(jié)合、整合素結(jié)合、硫酸乙酰肝素N-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性、膠原結(jié)合、蛋白結(jié)合、信號受體結(jié)合等方面。細(xì)胞成分主要集中在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，見圖9。KEGG通路分析表明，主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)及其受體相互作用，硫酸乙酰肝素生物合成，Rap1信號通路，Wnt信號通路，PI3K-Akt信號通路以及Ras信號通路等，見圖10。

圖9 EXT1及其50個共表達(dá)基因在肉瘤患者中的生物學(xué)功能富集分析

圖10 EXT1及其50個共表達(dá)基因在肉瘤患者中的KEGG分析

3 討論

目前，EXT1已經(jīng)證實與多發(fā)性骨軟骨瘤的發(fā)生相關(guān)，是一種常染色體顯性遺傳疾病，處于人類染色體8q23-24.1上的基因發(fā)生突變，所編碼的蛋白質(zhì)分別含有746個氨基酸，可形成異種寡聚物復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞表面硫酸乙酞肝素蛋白聚糖（HSPGs），HSPGs是生物學(xué)上最重要的糖結(jié)合物，在分子水平的各種事件中起著至關(guān)重要的作用[12]。有研究表明，HSPG參與細(xì)胞黏附、遷移、增殖和信號通路，影響腫瘤不同階段的進(jìn)展[13]。目前，相關(guān)文獻(xiàn)報道EXT1已被確定為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的分子生物標(biāo)志物[14]。近年來，EXT1突變在諸多腫瘤發(fā)生發(fā)展中的表現(xiàn)均有所報道，如肝癌[15]、急性淋巴細(xì)胞白血病[16]、多發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[17]、星形細(xì)胞瘤[18]和骨肉瘤[19]等。迄今為止，EXT1在不同類型人類肉瘤中的作用及其分子機制仍不清楚。為了更深入地了解EXT1在人類肉瘤中的表達(dá)、預(yù)后以及潛在功能，筆者對公共測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以指導(dǎo)肉瘤的未來研究，主要通過GEO和TCGA的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫進(jìn)行研究，EXT1在人類肉瘤組織樣本和細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯升高。高表達(dá)的EXT1與臨床病理特征（種族、年齡和TP53突變狀態(tài)）顯著相關(guān)，與性別無關(guān)。與相應(yīng)的正常細(xì)胞（hFOB1.19、HSMC、WI38）比較，EXT1在3種人類肉瘤細(xì)胞系（MG-63、SW872、HT1080）中基因mRNA和蛋白表達(dá)情況均呈顯著過表達(dá)。此外，肉瘤患者中EXT1的高表達(dá)與不良的OS和PFS相關(guān)，提示預(yù)后不良。還利用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了EXT1及其共表達(dá)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建EXT1及其共同表達(dá)基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)以獲得這些基因的相互作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫中的GO和KEGG對共表達(dá)基因的功能和通路富集分析，表明主要參與細(xì)胞分化、硫酸肝素蛋白聚糖代謝過程、細(xì)胞遷移、ECM受體相互作用，Rap1信號通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路以及Ras信號通路等參與調(diào)控。

綜上所述，EXT1在人類肉瘤中的高表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對患者的預(yù)后影響有著舉足輕重的作用，是非常有前途的潛在分子靶點和生物標(biāo)志物，有望成為早期診斷、治療和評估預(yù)后的生物標(biāo)志物。EXT1基因在人類肉瘤中可能是一個潛在的致癌基因，有必要對該基因在肉瘤中的作用機制及生物學(xué)功能進(jìn)行深入探討，全面了解其在惡性腫瘤中的作用，為肉瘤的診治提供更多診斷依據(jù)。該研究為EXT1在人類肉瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性及其作為人類肉瘤標(biāo)志物的潛力提供了理論依據(jù)，對人類肉瘤分子生物學(xué)特性的異質(zhì)性和復(fù)雜性進(jìn)行了較為全面的認(rèn)識。