衛(wèi)旭陽(yáng)，劉婷婷，翟錫姣，邢國(guó)明，鄭少文

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西太谷 030801）

菜豆（Phaseolus vulgarisLinn）是一種可以食用的豆科植物，俗稱四季豆或豆角，屬于豆科（Leguminosae sp.）菜豆屬的菜豆種，屬于1 年生草本矮生或蔓生植物，是以嫩豆莢和鮮豆粒作為菜用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1]，除含有礦物質(zhì)以及維生素外，還富含蛋白質(zhì)、脂肪和糖類，能夠促進(jìn)人體腸胃蠕動(dòng)，增進(jìn)食欲，促進(jìn)血液循環(huán)[2]?；ㄉ諏儆邳S酮類物質(zhì)，是以黃酮為基礎(chǔ)的一類物質(zhì)，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)中，在不同的酸堿度或金屬離子的作用下呈現(xiàn)出不同的顏色，因而賦予了植物五彩繽紛的顏色[3]?；ㄉ站哂蓄A(yù)防多種疾病和生理保健的作用，在調(diào)節(jié)眼健康、代謝紊亂、心血管疾病、抗腫瘤、清除自由基等方面起到了一定的作用[4]。花色苷的合成主要受內(nèi)因和外因的影響，內(nèi)因主要包括酶活性、糖代謝的影響，花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累相關(guān)的基因、調(diào)節(jié)基因、MicroRNA 等，外因主要包括氮肥、鉀肥、pH、溫度、光照、植物激素等[5-6]。

蕓苔素又稱油菜素內(nèi)脂，被稱為第六大植物激素，能夠顯著提高植物葉綠素含量，增加葉面積，促進(jìn)植物光合作用，提高植物抗逆性[7]。前人研究表明，外源噴施蕓苔素能夠顯著增加葡萄果皮中花色苷的含量[8-9]。彭志紅[10]在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，蕓苔素通過(guò)對(duì)茉莉素的誘導(dǎo)來(lái)調(diào)控?cái)M南芥中花青素的合成；袁利兵等[11]研究表明，在擬南芥中，蕓苔素會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素的合成來(lái)影響花青素合成下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥中花青素的合成。在關(guān)于蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花色苷合成方面及其影響調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

本研究以紫架豆、紫龍架豆、東方紅架豆、紫地豆為材料，研究花色苷積累與不同質(zhì)量濃度蕓苔素之間的關(guān)系，旨在為菜豆豆莢花色苷富集、品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料紫架豆（A1）、紫龍架豆（A2）、東方紅架豆（A3）、紫地豆（A4）由石家莊先鳳種業(yè)有限公司提供。蕓苔素由山東貴合生物公司提供，有效成分含量為0.01%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料提前20 d 進(jìn)行培養(yǎng)箱育苗，至兩葉一心時(shí)定植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院日光溫室內(nèi)，盆栽定植，栽培盆內(nèi)徑21 cm、高20 cm，每盆裝混合基質(zhì)3 kg。每個(gè)處理6 盆，每盆1 穴，每穴2 株，重復(fù)3次。每個(gè)處理之間行間距50 cm，列間距50 cm。定植后進(jìn)行常規(guī)田間管理。定植14 d 后開(kāi)始使用蕓苔素進(jìn)行處理，處理濃度為0（清水對(duì)照，B1）、0.05（B2）、0.10（B3）、0.15（B4）、0.20 mg/L（B5）。每14 d噴施1 次，共噴施3 次，分別對(duì)應(yīng)菜豆苗期、伸蔓期、開(kāi)花結(jié)莢期。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 次生代謝物指標(biāo)測(cè)定 采新鮮豆莢，至于冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，類黃酮含量使用硝酸鋁法測(cè)定[12]；豆莢花青素含量使用鹽酸甲醇法測(cè)定[13]；原花青素含量使用鹽酸-香草醛法測(cè)定[14]；花色苷含量使用pH 示差法測(cè)定[15]。

1.3.2 花色苷合成關(guān)鍵酶活性測(cè)定 取新鮮豆莢，并立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)（北京索萊寶科技有限公司提供），測(cè)定查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、二氫黃酮醇還原酶（DRF）、花青素合成酶（ANS）、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣2 株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，利用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和Duncan 法多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆總黃酮含量的影響

花色苷屬于黃酮類物質(zhì)，總黃酮含量能夠較為直觀的表現(xiàn)出花色苷合成通路中各成色物質(zhì)的總積累量，進(jìn)而反映出蕓苔素對(duì)于菜豆豆莢花色苷合成的影響。從表1 可以看出，不同濃度的蕓苔素對(duì)于菜豆豆莢中總黃酮的含量會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，經(jīng)過(guò)濃度B3 的蕓苔素處理之后，各品種均與對(duì)照間差異差異，菜豆A1、A2、A3、A4 品種的總黃酮含量分別比對(duì)照高出了67.21%、36.62%、43.01%、58.47%，品種A1、A4 在濃度B3 時(shí)總黃酮含量最高，品種A2、A3 則在濃度B4 時(shí)總黃酮含量最高，且均與其對(duì)照間差異差異，噴施蕓苔素可以增加菜豆豆莢中總黃酮的含量，但隨著濃度的升高總黃酮含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，噴施蕓苔素對(duì)菜豆總黃酮合成起到了促進(jìn)作用。

表1 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆總黃酮含量的影響Tab.1 Effects of different mass concentrations of brassin on the content of total flavonoids in beans mg/g

2.2 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆原花青素含量的影響

原花青素是花色苷合成通路上的中間物質(zhì)，原花青素含量的高低可以反映出蕓苔素影響的花色苷合成的過(guò)程。由表2 可知，不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理后，菜豆豆莢中的原花青素含量產(chǎn)生了不同程度的變化，品種A1 表現(xiàn)為不同處理相較于對(duì)照組原花青素含量分別增加了25%、44%、8%、0，B2、B3 處理與對(duì)照間差異顯著，B3 處理的原花青素含量最高；品種A2 在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理下原花青素含量較對(duì)照分別增加了34%、55%、16%、16%，且B2、B3 處理與對(duì)照組B1 間差異顯著，B3處理的原花青素含量最高；品種A3 在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理下原花青素含量較對(duì)照組分別增加了40%、172%、116%、40%，B3、B4 處理與對(duì)照B1間差異顯著，其中，B3 處理的原花青素含量最高；品種A4 在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理下原花青素含量分別提高了5%、55%、22%、77%，在B3、B4 處理下與對(duì)照組間差異顯著，其中，B5 處理下原花青素含量最高；說(shuō)明經(jīng)過(guò)EBR 處理能夠顯著增加菜豆豆莢原花青素的含量，且濃度B3 對(duì)各個(gè)品種均產(chǎn)生了顯著影響。

表2 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆原花青素含量的影響Tab.2 Effects of different mass concentrations of brassin on procyanidins content in beans mg/g

2.3 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆花青素含量的影響

花青素是花色苷合成的前體物質(zhì)。由表3可知，在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理下，品種A1 豆莢中花青素含量較對(duì)照組分別提高了68.92%、139.54%、114.68%、59.32%，其中，B3處理的花青素含量最高，且只有B3 處理與對(duì)照間差異顯著；品種A2 各處理較對(duì)照組分別提高了13.83%、50.59%、34.38%、20.15%，其中，B3 處理的花青素含量最高，且B2、B3、B4、B5 處理均與對(duì)照間差異顯著；品種A3 表現(xiàn)為各處理較對(duì)照組花青素含量分別降低34.40%、8.40%、20.77%、15.58%，其中，對(duì)照組的花青素含量是最高的，B2 處理較對(duì)照組顯著減少；品種A4在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理下較對(duì)照組花青素含量產(chǎn)生了不同程度的變化，不同處理下花青素含量分別增加了61.18%、100%、119.07%、103.94%，其中，花青素含量最高的是B4 處理，B2、B3、B4、B5處理均與對(duì)照組間差異顯著。在B3 處理下能夠顯著增加各品種菜豆豆莢花青素的含量。

表3 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花青素含量的影響Tab.3 Effects of different mass concentrations of brassin on anthocyanin content in bean pods mg/g

2.4 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆花色苷含量的影響

從表4 可以看出，不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆花色苷合成產(chǎn)生不同程度的影響，品種A1 表現(xiàn)為，各處理相較于對(duì)照花色苷含量分別提高了61.45%、44.19%、37.91%、30.66%，其中，B2 處理的花色苷含量最高，且其他處理均與對(duì)照組間差異顯著；品種A2 表現(xiàn)為各處理相較于對(duì)照組花色苷含量分別提高了20.06%、34.61%、23.70%、29.64%，且各處理均與對(duì)照組間差異顯著；品種A3 表現(xiàn)為B3 處理花色苷含量最高，相較于對(duì)照組含量提高了52.66%；品種A4 表現(xiàn)為，B4 處理花色苷含量最高，相較于對(duì)照組提高了114.51%，B3、B4 處理下，能夠顯著增加各品種菜豆豆莢中花色苷的含量。

表4 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花色苷含量的影響Tab.4 Effects of different mass concentrations of brassin on the content of cyanins in bean pods mg/g

2.5 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢查爾酮異構(gòu)酶（CHI）活性的影響

查爾酮異構(gòu)酶能夠催化查爾酮環(huán)的閉合，形成類黃酮物質(zhì)。由圖1 可知，在不同質(zhì)量濃度蕓苔素處理之后品種A1、A4 表 現(xiàn) 為B2 處理 下CHI 活 性最高，品種A2 表現(xiàn)為B4 處理下CHI 活性最高，品種A3 表現(xiàn)為B1 處理下CHI 活性最高，且與其他處理間差異顯著，說(shuō)明外源噴施蕓苔素并不能顯著影響到CHI 活性。

圖1 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢查爾酮異構(gòu)酶（CHI）活性的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations of brassin on chalcone isomerase（CHI） activity in bean pods

2.6 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢二氫黃酮醇還原酶（DFR）活性的影響

二氫黃酮醇還原酶（DFR）的作用是將二氫黃酮醇還原為無(wú)色花色素，無(wú)色花色素是花青素合成的前提物質(zhì)。由圖2 可知，不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)豆莢中DFR 活性產(chǎn)生不同程度的影響，低質(zhì)量濃度時(shí)并未與對(duì)照產(chǎn)生較大差異，隨著濃度的升高DFR 活性也在逐漸升高，當(dāng)達(dá)到B3 時(shí)，品種A3、A4 的DFR 活性達(dá)到最高，且與其他處理間差異顯著，當(dāng)B4 處理下品種A1 的DFR 活性達(dá)到最大，但在噴施蕓苔素之后，品種A1、A2 的DFR 活性出現(xiàn)降低，由此可知，這2 個(gè)品種對(duì)于蕓苔素并不敏感，濃度B3 對(duì)菜豆豆莢DFR 活性影響較大。

圖2 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢二氫黃酮醇還原酶（DFR）活性的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of brassica on dihydroflavonol reductase（DFR）activity in bean pods

2.7 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花色素合酶（ANS）活性的影響

花色素合酶（ANS）的作用是催化無(wú)色花色素合成花色素，花色素是花色苷合成的前體物質(zhì)。由圖3 可知，不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)ANS 活性產(chǎn)生不同程度的影響，A1 品種的處理B4 相較于對(duì)照酶活提高21.39%，但并未與對(duì)照產(chǎn)生顯著性差異；A2品種的B3 處理相較于對(duì)照酶活提高了26.65%，且與對(duì)照間差異顯著；A3 品種的B3 處理相較于對(duì)照提高了32.4%，且與對(duì)照間差異顯著；A4 品種的B3處理相較于其對(duì)照酶活性升高了18.33%，但并未與對(duì)照產(chǎn)生顯著性差異，由此可知，外源噴施B3 濃度的蕓苔素能夠提高菜豆豆莢中ANS 活性，并能夠顯著影響品種A2 和A3。

圖3 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花色素合酶（ANS）活性的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of brassin on anthocyanin synthase（ANS） activity in bean pods

2.8 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性的影響

不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性的影響如圖4 所示。

圖4 不同質(zhì)量濃度蕓苔素對(duì)菜豆豆莢類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of brassin on flavonoid glycosyltransferase（UFGT）activity in bean pods

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）能夠催化不穩(wěn)定的花色素與葡萄糖進(jìn)行結(jié)合，形成穩(wěn)定的花色苷，這是花色苷合成的最后一步。由圖4 可知，A1 品種的處理B4、B5 較對(duì)照的UFGT 活性分別提高了16.48%、11.75%，且均與對(duì)照間差異顯著；A2 品種的B2、B3、B5 處理與其對(duì)照間差異顯著，酶活性較對(duì)照分別提高了43.09%、50.72%、39.28%；品種A3 的各處理相較于對(duì)照均產(chǎn)生顯著性差異，酶活性較對(duì)照分別提高了40.30%、31.50%、20.55%、50.92%，其中，B5 處理的酶活性最高；A4 品種的B2 與B3 處理較對(duì)照酶活性分別提高了48.65%、38.56%，并與對(duì)照間差異顯著。由此可見(jiàn)，外源噴施濃度B2、B3 蕓苔素能夠顯著增加品種A2、A3、A4 豆 莢 中UFGT 活 性。

2.9 花色苷合成相關(guān)物質(zhì)與相關(guān)酶活的相關(guān)性分析

由表5 可知，原花青素含量與花青素含量、花色苷含量呈極顯著正相關(guān)，DFR 活性與原花青素含量和花色苷含量呈顯著正相關(guān)，ANS 活性與原花青素含量、花青素含量呈顯著正相關(guān)，且ANS 活性與UFGT 活性間呈顯著相關(guān)。

表5 花色苷合成通路相關(guān)物質(zhì)含量與相關(guān)酶活性的相關(guān)性Tab.5 Correlation between the content of related substances in anthocyanin synthesis pathway and related enzyme activities

3 結(jié)論與討論

本研究表明，在正常生長(zhǎng)條件下，外源噴施蕓苔素能夠顯著增加菜豆豆莢中總黃酮、原花青素、花色素以及花色苷的含量，不同濃度蕓苔素對(duì)菜豆中各成色物質(zhì)影響程度各不相同，這與高翔等[16]在釀酒葡萄中研究結(jié)果相同。馬文婷等[17]對(duì)蛇龍珠葡萄的研究表明，外源噴施蕓苔素能夠提高果實(shí)內(nèi)源ABA 的含量，而ABA 直接參與到葡萄果實(shí)花色苷的合成，進(jìn)而促進(jìn)了花色苷的合成。謝琳淼等[18]研究表明，在藍(lán)莓的著色期通過(guò)噴施0.4 mg/L 的蕓苔素內(nèi)酯可以顯著提高其花色苷的含量。

本研究表明，不同濃度蕓苔素對(duì)菜豆花色苷合成通路上各關(guān)鍵酶活性產(chǎn)生不同程度的影響。在花色苷合成通路上，查爾酮經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶催化形成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇在類黃酮3′5′-羥化酶（F3′5′H）或者類黃酮3′-羥化酶（F3′H）催化作用下合成二氫楊黃酮或者二氫槲皮素，在二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）催化作用下合成原花青素，原花青素在花色素合酶（ANS）催化下合成花青素，花青素通過(guò)類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）催化合成花色苷。原花青素、花青素含量能夠直觀表現(xiàn)出花色苷合成過(guò)程中各物質(zhì)的變化量，以及蕓苔素對(duì)花色苷合成通路的影響[19-21]。不同濃度蕓苔素處理之后對(duì)菜豆豆莢中CHI 活性并未產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)DFR、ANS、UFGT 等關(guān)鍵酶活性產(chǎn)生了顯著影響，顯著提高了其酶活性。這與馬立娜等[22-23]蕓苔素內(nèi)酯在葡萄果實(shí)花色苷合成研究中的結(jié)論相同，外源蕓苔素能夠顯著增加葡萄果實(shí)中UFGT 活性。DFR、ANS 活性的提高都能夠顯著提高菜豆中原花青素含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，蕓苔素通過(guò)對(duì)CHI 等花色苷合成相關(guān)酶活性的影響，來(lái)影響豆莢中花色苷的合成，即噴施蕓苔素能夠顯著提高DFR 活性，增加了原花青素的合成，來(lái)增加花色苷合成通路中上游底物的合成；通過(guò)提高ANS 活性，增加了花青素的含量；通過(guò)對(duì)UFGT 活性的增加，促進(jìn)了花色苷的合成，增加菜豆豆莢中花色苷的含量。

本研究表明，外源噴施0.1 mg/L 蕓苔素能夠顯著增加菜豆中總黃酮、原花青素、花青素及花色苷含量，能夠顯著提高豆莢中CHI、ANS、UFGT 活性，但對(duì)于蕓苔素對(duì)菜豆豆莢花色苷合成的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。