劉紫嫣 孫于寒 彭浩 王夢姣

(陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西 漢中 723000)

前言

納豆自唐朝傳入日本,是一種由豆類經(jīng)過納豆菌發(fā)酵而成的食品,其特點為本身帶有一定的黏性和較臭的氣味以及微甜的味道[1]。一般為偏中生、孢囊不膨大、具有鞭毛,對溫度、pH值以及膽鹽等有較高的耐受性[2]。納豆激酶是由納豆芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的一種具有纖溶作用的絲氨酸蛋白酶[3],在保健產(chǎn)品開發(fā)上具有良好的應(yīng)用前景。

本研究以我國云南、貴州、陜西和湖南等不同產(chǎn)地的豆豉為研究材料，對其中的納豆菌株進行篩選鑒定，并探究了其對溫度、pH的耐受性，結(jié)果獲得4株高產(chǎn)納豆激酶，且對溫度和pH具有高耐受性的納豆芽孢桿菌，以期為納豆產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒。以期為解決上述問題提供優(yōu)質(zhì)菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

云南豆豉，云南易門山里香食品有限責任公司；貴州豆豉，貴州華瑞名鼎食品有限公司；陜西豆豉，市售；湖南豆豉，湖南華越食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.1.2.1 NBP培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、瓊脂20.0g、去離子水1.0L。

1.1.2.2 脫脂奶培養(yǎng)基

10%脫脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%瓊脂，pH 7.2～7.4。

1.1.2.3 液體種子培養(yǎng)基

不添加瓊脂的NBP培養(yǎng)基。

1.1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

胰蛋白胨20.0g、Na2HPO45.0g、NaH2PO41.5g、葡萄糖20.0g、CaCl20.2g、MgSO40.3g、去離子水1.0L。

1.2 方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌的分離純化

將云南、貴州、陜西、湖南4地豆豉25.0g加入裝有225mL的均質(zhì)袋中(均質(zhì)壓力為200MPa)，均質(zhì)好的菌懸液進行10-4、10-5、10-63個梯度稀釋。用移液器取10-4、10-5、10-6進行梯度稀釋液各200μL在NBP平板上，于37℃倒置培養(yǎng)48h[6]；采用連續(xù)劃線的方法進行純化，并將純化后的菌株進行低溫保藏[7]。

1.2.2 納豆菌的篩選

制備(濃度)納豆菌懸液，吸取20μL置于脫脂奶培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)48h。分別測定透明圈直徑和菌落直徑，計算R(透明圈直徑/菌落直徑),求出R平均值。每組處理均設(shè)置3個重復。選取R平均值較大的菌株進行下一步實驗。

1.2.3 納豆激酶活力測定

用Folin-酚法測定初篩到的10株菌株的酶活力，選取納豆激酶活力最高的菌株作為復篩的目標菌株。

1.2.4 種子液的制備

挑取試管斜面納豆菌至液體種子培養(yǎng)基(裝液量為50/250mL)，并在37℃，180r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48h[8]，備用。

1.2.5 粗酶液的制備

將納豆菌液體種以2%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，并在37℃，180r·min-1的條件下培養(yǎng)48h。離心(10000r·min-1，30min)獲得含有納豆激酶的發(fā)酵上清液，備用。

1.2.6 納豆激酶的活性測定

1.2.6.1 酪氨酸標準曲線的制作

取7支試管，在680nm的波長下分別測定各管的吸光度。以O(shè)D680值為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線[9]。見表1(1號試管為不含酪氨酸的空白對照)。

表1 酪氨酸標準曲線

1.2.6.2 納豆激酶酚法酶活測定

將1%的酪蛋白溶液放入37%的水浴中預熱5～10min；取3支試管編號為1、2、3(1為空白對照，2、3為平行樣品)，在3支試管中加入1%的酪蛋白溶液1.0mL,于37%恒溫水浴下預熱5～10min。在試管1中加入10%三氯乙酸溶液4mL，在試管2、3中加入1%的待測酶液1.0mL。將試管1、2、3置于37℃的恒溫水浴10～15min；向3支試管中加入10%三氯乙酸溶液4mL。靜置，離心15min(4000r·min-1)。離心結(jié)束后取1.0mL的上清液于另外3支試管中，加入5.0mL的0.55mol·L-1Na2CO3溶液和福林酚試劑1.0mL,進行顯色反應(yīng)[10]；用酶標儀測定680nm樣品吸光度。先用空白調(diào)零，再分別測定樣品平行1、2、3的吸光度，取平均值為各樣品的吸光度。

1.2.7 納豆芽孢桿菌的鑒定

采用《伯杰細菌鑒定手冊》[11]第8版對分離得到的菌株進行項生理生化鑒定實驗。

1.2.8 納豆激酶高產(chǎn)菌株的特性研究

1.2.8.1 對溫度的耐受性

將菌株用基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,取發(fā)酵液1mL,采用無菌操作,稀釋到一定的倍數(shù),分別置于溫度92℃和96℃中水浴10min、15min和20min,流水冷卻,以室溫下未經(jīng)水浴的菌株作為對照,采用平板計數(shù)法計算水浴后菌株的存活率,據(jù)此判斷其對溫度的耐受性[12]。

1.2.8.2 對pH值的耐受性

配制2種不同的pH緩沖液，取不同的量配成不同pH的溶液，其中,A液為0.1mol·L-1的檸檬酸溶液，B液為0.2mol·L-1的磷酸氫二鈉。將菌株接種于基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基,在溫度37℃,轉(zhuǎn)速150r·min-1下振蕩培養(yǎng)24h,使菌種的OD600值控制在1.5～1.6,并將此種子液保存?zhèn)溆肹13]。將此種子液以一定量接種于具有不同pH值的基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基中,于溫度37℃下培養(yǎng)45min,取培養(yǎng)液1mL,經(jīng)適當稀釋后,涂布平板計數(shù),計算相對存活率,以此判斷其對pH值的耐受性。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆芽孢桿菌的分離純化結(jié)果

根據(jù)納豆芽孢桿菌的特性，將4個產(chǎn)地的豆豉樣品進行稀釋涂布培養(yǎng)后，分離出了30株菌落形態(tài)不同的菌株。云南5株，編號為N1～N5；貴州10株，編號為G1～G10；陜西8株，編號為S1～S8；湖南7株，編號為H1～H7。菌落呈白色或微黃色，濕潤、黏稠，不透明或微透明，表面褶皺，具有芽孢桿菌的形態(tài)特征。

2.2 產(chǎn)納豆激酶菌株的篩選結(jié)果

在牛肉膏培養(yǎng)基進行畫線培養(yǎng)，分離出單一的菌落,并在脫脂奶培養(yǎng)基平板上點樣,結(jié)果見圖1。測量透明圈直徑和菌落直徑,計算比值R(R=透明圈直徑/菌落直徑)。

從圖1可知，N2、G1、S3、H3的R值最大，可初步判斷其產(chǎn)酶能力最強。

圖1 篩選結(jié)果

2.3 納豆芽孢桿菌菌株復篩結(jié)果

2.3.1 酪氨酸標準曲線

按1.2.3的方法，測得波長680nm下各試管的吸光度，見表2。根據(jù)表2所得數(shù)據(jù)，繪制以吸光度為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標的標準曲線[14]，如圖2。(根據(jù)回歸方程計算吸光常數(shù)K，即吸光度為1時酪氨酸μg數(shù))。根據(jù)圖2可知，K=72.97。

表2 酪氨酸標準曲線

圖2 酪氨酸標準曲線

2.3.2 納豆激酶活力值

酶活力定義：在37℃，pH 7.4的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量為一個酶活力單位。根據(jù)所述方法測得各菌株的吸光度，并代入公式計算各菌株的酶活力，結(jié)果見表3。

酶活力計算公式：

酶活力(U·mL-1)=[A/(T×W)]×K×V×N

式中，A為平均吸光度；T為反應(yīng)時間10min；W為反應(yīng)酶液體積1mL；K為吸光常數(shù)72.97；V為反應(yīng)液總體積5mL；N為稀釋倍數(shù)100。

表3 初篩菌株酶活力結(jié)果

根據(jù)目前國內(nèi)報道的納豆激酶活性大多為600～900U·mL-1[15],部分高產(chǎn)納豆激酶酶活力為1137.15～1222.727U·mL-1[16-18]。此外，還有研究通過誘變得到的高產(chǎn)納豆激酶菌株，酶活可達1846.15～2095.23U·mL-1[19]。由表3可知，從4個產(chǎn)地獲得菌株中，N2、G1、S3、H3,酶活力分別為1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1，屬于高產(chǎn)酶活的菌株。

2.4 納豆芽孢桿菌的鑒定

將N2、G1、S3、H3以枯草芽孢桿菌為對照，各項具體指標結(jié)果見表4。

表4 納豆芽孢桿菌的鑒定

由表4可知，篩選得到的N2、G1、S3、H3的理化性質(zhì)為革蘭氏反應(yīng)、芽孢染色、葡萄糖實驗、木糖實驗、蔗糖實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、淀粉水解實驗、明膠實驗、酪氨酸實驗、產(chǎn)過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗均與對照組枯草芽孢桿菌一致，由此可以判斷這4株菌均為枯草芽孢桿菌。

2.5 納豆激酶高產(chǎn)菌株的特性研究

2.5.1 對溫度的耐受性

菌株在制粒的過程中會遇到瞬時高溫,以及在運輸儲存的過程中會遇到高溫的影響，所以菌株對溫度的耐受性表現(xiàn)的越強,則菌種的活性越好,越不容易受到溫度的影響而死亡。

本實驗選用了92℃和96℃分別進行實驗。N2、G1、S3、H3存活率與溫度的關(guān)系見表5。

通過實驗可知，N2、G1、S3、H3的存活率受溫度的影響很大。條件為92℃和96℃水浴5min時，同一菌株的存活率相差較為明顯，相差達39%左右；隨著時間的增加，同一菌株的存活率差值逐漸降低，在10min時，同一菌株的存活率差值約為12%，不足15%。當時間在15min時，二者的存活率僅為4%左右。當時間在20min時，N2和S3還有0.11%、0.06%的存活率，剩下的G1和H3均被殺死。

因此,菌株N2和S3相對于G1和H3具有較強的溫度耐受性。

表5 納豆芽孢桿菌存活率與溫度的關(guān)系

2.5.2 對pH的耐受性

納豆芽孢桿菌作為菌劑在生產(chǎn)使用以及儲存的過程中,經(jīng)常會遇到不同的pH,因此有必要考慮pH對菌種的影響以及其適應(yīng)性。結(jié)果見表6。

表6 納豆芽孢桿菌存活率與pH的關(guān)系

由表6可知，N2、G1、S3、H3對不同pH值范圍表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性。pH范圍6.60～7.00的條件時，均達到85%以上，可見存活率都很高。pH為2.0～5.10的范圍內(nèi)，4種菌株的存活率均受pH的影響較大。而在pH為2.20、3.30以及9.50時存活率損失很大，達到50%。因此菌株在偏酸以及偏堿的條件下不利于生長。通過比較，N2和S3具有較強的pH耐受性。

3 討論

本實驗采用稀釋涂布法從云南、貴州、陜西、湖南4個產(chǎn)地豆豉樣品中分離篩選出30株目標菌株，由產(chǎn)蛋白酶的特性，并測定納豆激酶活性，從4個地方各篩選出具有高產(chǎn)納豆激酶的菌株[20]：N2、G1、S3、H3，酶活力分別為1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1。

通過對高產(chǎn)納豆激酶菌株N2、G1、S3、H3進行了溫度、pH的耐受性研究，得出如下結(jié)論:N2和S3相較G1和H3而言，對溫度、pH的耐受性較強。在生產(chǎn)中若采用N2、S3菌種進行納豆的生產(chǎn)，在確保質(zhì)量的前提下，可減少納豆的發(fā)酵時間，為企業(yè)以及廠家?guī)斫?jīng)濟效益。N2、S3菌種對環(huán)境(溫度和酸堿度)耐受更強，可在納豆生產(chǎn)環(huán)境受不可控因素影響時，保證產(chǎn)品的質(zhì)量，保護企業(yè)、廠家的經(jīng)濟效益。并且N2、S3菌種對菌株運輸、儲藏環(huán)境的要求相比其他菌株較低，同環(huán)境下更好地確保菌株存活率，節(jié)約了成本。該菌株對后續(xù)納豆激酶的研究，起到了一定的作用，有望作為納豆工藝生產(chǎn)的工業(yè)菌株，對于提高我國豆豉的質(zhì)量、檔次以及在國際市場中的地位都具有良好的實用價值。