林慧，許承明，文平，胡素熔，段金良

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二四醫(yī)院生殖中心，桂林 541002)

地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是人類最常見的單基因遺傳性疾病之一，主要包括α和β兩種類型[1]。中國(guó)南方是地貧的高發(fā)區(qū)，尤其是兩廣地區(qū)(廣西、廣東)。既往研究顯示，廣西地區(qū)α地貧攜帶率為17.55%，β地貧攜帶率為6.43%[2]。從患者臨床癥狀分析，靜止型攜帶者無貧血癥狀，屬于健康人群；輕型主要表現(xiàn)為輕微貧血癥狀，對(duì)健康威脅不大；中間型和重型地貧(包括α和β地貧)均為致殘或致死性遺傳血液病[3]。目前關(guān)于嚴(yán)重類型地貧患者的自然生育狀況已經(jīng)有較多報(bào)道[4-6]，而對(duì)于輕型地貧患者的生育狀況鮮有關(guān)注。本研究回顧性分析本生殖中心輕型地貧患者行輔助生殖技術(shù)(ART)助孕后的妊娠結(jié)局，以期為臨床研究提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年1月1日至12月31日在本生殖中心經(jīng)地中海貧血基因檢測(cè)確診為輕型地貧，且首次取卵行ART治療的夫婦為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女性年齡<35歲；夫妻雙方染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)正常；夫妻雙方均行地貧基因、血紅蛋白電泳檢測(cè)，一方確診為輕型地貧；血常規(guī)示平均紅細(xì)胞體積(MCV)<80 fl和(或)平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)<27 pg；因輸卵管因素行助孕治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方合并器質(zhì)性病變(如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病等)、內(nèi)分泌疾病(如多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能亢進(jìn)、高泌乳素血癥等)或其他單基因遺傳疾病。

共納入一方為輕型地貧的174對(duì)夫婦，按照男、女方地貧基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組：女性輕型組(其配偶地貧基因正常)88例，共88個(gè)取卵周期、111個(gè)移植周期；男性輕型組(其配偶地貧基因正常)86例，共86個(gè)取卵周期、115個(gè)移植周期。選擇同期來院治療、夫妻雙方地貧基因檢測(cè)正常的100例不孕癥婦女為非地貧組(100個(gè)取卵周期，126個(gè)移植周期)。

二、研究方法

1.基因檢測(cè)：因地中海貧血發(fā)生具有明顯的地域性，本中心對(duì)初次行ART助孕的夫婦常規(guī)進(jìn)行地貧基因檢測(cè)。抽取男女雙方外周血2 ml，EDTA抗凝后，采用DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化)提取血液DNA。α地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(Gap-PCR法)、非缺失型α地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR探針法)、β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR探針法)均購自深圳益生堂生物企業(yè)有限公司。按照上述試劑盒說明書操作，使用ABI2720 PCR儀(Thermo，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增。地貧點(diǎn)突變型運(yùn)用PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)膜條雜交技術(shù)檢測(cè)，缺失型采用多重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目包括β地貧(常見17種突變)、α地貧點(diǎn)突變型(CS、QS、WS突變)、α-地貧缺失型(-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI)，罕見型地貧不在本檢測(cè)范圍內(nèi)。

2.促排卵及IVF-ET：采用長(zhǎng)方案、拮抗劑方案促排卵，行常規(guī)IVF或ICSI授精，胚胎培養(yǎng)至D5、D6囊胚，行新鮮囊胚移植，移植1～2枚囊胚(至少含1枚優(yōu)質(zhì)囊胚)。剩余囊胚冷凍保存，擇期行凍胚復(fù)蘇再移植。使用黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)進(jìn)行黃體支持，移植后30 d行超聲檢查，宮腔內(nèi)見妊娠囊視為臨床妊娠。

3.觀察指標(biāo)：收集3組患者的D3胚胎數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、囊胚形成數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、胎兒畸形率、多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、異位妊娠率等。種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%，臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%，早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%，多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，胎兒畸形率=畸形胎兒數(shù)/總的胎兒數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況

3組患者的一般資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH(bFSH)、抗苗勒管激素(AMH)水平比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。女性輕型組(88例)中α地貧55例，β地貧33例；男性輕型組(86例)中α地貧60例，β地貧26例，具體基因信息見表2。

表2 輕型地貧患者基因信息情況表

二、3組患者胚胎發(fā)育情況比較

3組間D3胚胎數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、囊胚形成數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)比較，女性輕型組較高，非地貧組較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組間D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率比較，女性輕型組的D3優(yōu)質(zhì)胚胎率較高，男性輕型組的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率較高，非地貧組相對(duì)較低，但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

三、3組患者妊娠結(jié)局比較

女性輕型組共移植111個(gè)周期，男性輕型組115個(gè)周期，非地貧組126個(gè)周期。3組間比較，女性輕型組、男性輕型組的臨床妊娠率、種植率略高于非地貧組；女性輕型組的流產(chǎn)率和胎兒畸形率較其他兩組有增高的趨勢(shì)，但均無顯著性差異(P>0.05)；3組患者的多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、異位妊娠率比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

女性輕型組的胎兒總數(shù)61個(gè)，其中3例孕婦的5個(gè)胎兒(2例為雙胎妊娠)于孕22周發(fā)現(xiàn)畸形，畸形率為8.2%(5/61)。其中1例孕婦的胎兒重度唇腭裂，于孕23周孕婦要求引產(chǎn)；1例孕婦為雙胎妊娠，1胎顱腦畸形、1胎手腳畸形，已于孕24周引產(chǎn)；另1例孕婦也為雙胎妊娠，孕24周發(fā)現(xiàn)雙胎均為心臟畸形，夫妻倆考慮后堅(jiān)持妊娠至足月分娩，1例新生兒輕度先天性心臟病，另1例新生兒重度先天性心臟病出生已夭折(表4)。

男性輕型組胎兒總數(shù)69個(gè)，未發(fā)現(xiàn)明顯胎兒畸形。非地貧組的胎兒總數(shù)62個(gè)，胎兒畸形率為1.6%，1例胎兒因孕22周發(fā)現(xiàn)重度唇腭裂于孕24周孕婦要求引產(chǎn)(表4)。其余活產(chǎn)的新生兒于出生后1個(gè)月內(nèi)隨訪均健康。

討 論

地貧是世界范圍的公共健康問題，據(jù)估計(jì)，攜帶地貧基因的人口約占全球總?cè)丝诘?%[7]。α地貧以缺失型為主，β地貧以點(diǎn)突變?yōu)橹?。我中心?duì)初次來就診的2 914對(duì)不孕不育夫婦進(jìn)行常規(guī)的地貧基因檢測(cè)，其中檢出輕型地貧符合入組要求的：α地貧115例，檢出的基因型有--SEA/αα、-α3.7/-α4.2、αCSα/αWSα，以--SEA/αα為主；輕型β地貧59例，檢出的基因型有41-42M/βN、17M/βN、71-72M/βN，以41-42M/βN為主。

本研究納入的174對(duì)輕型地貧夫婦中，按照男、女方基因檢測(cè)結(jié)果分為女性輕型組(88例)、男性輕型組(86例)，同時(shí)納入非地貧組(100例)作為參照。3組間胚胎發(fā)育的各項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示輕型地貧對(duì)卵子及精子的發(fā)育并無明顯影響。女性輕型組與男性輕型組的臨床妊娠率及種植率比非地貧組略高，但無顯著性差異(P>0.05)，提示輕度地貧并不明顯影響胚胎的著床；男性輕型組的流產(chǎn)率及胎兒畸形率與非地貧組相近，且兩組均有低于女性輕型組的趨勢(shì)，提示女性輕型地貧可能會(huì)增加不良妊娠的概率，但3組間并沒有顯著性差異(P>0.05)，這可能與樣本量有限有關(guān)。本研究結(jié)果顯示女性輕型組中有5例胎兒畸形，包括唇腭裂、顱腦畸形、手腳畸形、先天性心臟病，不能排除孕期孕婦貧血狀態(tài)對(duì)胎兒器官發(fā)育的影響。但因?yàn)楸狙芯考{入的樣本數(shù)有限，且男方、女方同時(shí)為輕型地貧患者的例數(shù)太少未納入研究，故研究結(jié)論存在一定局限性，后續(xù)需要更大樣本量的研究加以探討。

關(guān)于地貧患者的生殖結(jié)局，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)研究。蘭李想等[8]與黃曉菊等[9]曾分析健康孕婦、輕型α地貧及中間型α地貧孕婦3組間妊娠期血紅蛋白、鐵蛋白水平及新生兒體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示3組孕婦妊娠期血紅蛋白水平依次降低，鐵蛋白水平依次升高，新生兒體質(zhì)量依次降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。也有觀點(diǎn)認(rèn)為胎兒在母體中生長(zhǎng)發(fā)育可使地貧孕婦貧血程度進(jìn)一步加重，孕婦的免疫力降低，從而對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響[10-11]。國(guó)外曾有研究對(duì)β地貧攜帶者夫婦的生殖結(jié)局進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，β地貧攜帶者夫婦有更高的生育力(平均懷孕次數(shù)2.457 vs. 1.480次)，更高的嬰兒死亡率(3.5% vs. 1.3%)，更高的10歲以下兒童死亡率(7.0% vs. 2.7%)；重型β地貧患者的新生兒死亡率較正常人群新生兒高約2倍，嬰兒死亡率高約3倍，每1 000例活產(chǎn)兒10歲以下死亡率高約3倍[12]。但因?yàn)楸狙芯考{入患者中大部分為外地孕婦，妊娠后多數(shù)回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院建卡，妊娠期血紅蛋白、鐵蛋白水平等數(shù)據(jù)缺失，故無法對(duì)這部分資料對(duì)新生兒結(jié)局的影響進(jìn)行分析。

在地貧高發(fā)區(qū)，育齡夫婦生育前常規(guī)行地貧基因檢測(cè)是必要的。據(jù)張明鏡等[13]報(bào)道，只通過血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果選擇性篩查地貧基因，可能造成約80%的α2-地貧(-α3.7、-α4.2)漏診。嚴(yán)重型地貧兒對(duì)家庭以及社會(huì)都是沉重的負(fù)擔(dān)。若夫妻雙方均為地貧攜帶者，如有必要可于孕早期或中期行產(chǎn)前診斷，對(duì)于嚴(yán)重型地貧胎兒進(jìn)行引產(chǎn)。雖然此方式可避免嚴(yán)重型地貧兒的出生，但會(huì)給孕婦的身心帶來嚴(yán)重傷害。隨著生殖與遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，近年來可以通過第三代試管嬰兒技術(shù)(胚胎植入前遺傳學(xué)診斷)來篩選正常的胚胎種植，避免后期引產(chǎn)的痛苦[14-15]。

ART的妊娠結(jié)局受到許多因素的影響，如女方年齡、促排方案、授精方式、胚胎培養(yǎng)環(huán)境等。本研究設(shè)計(jì)存在一定的不足，比如納入樣本數(shù)相對(duì)較少、沒有分別對(duì)α及β地貧類型進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)；另外，因?yàn)闃颖玖坑邢逈]有對(duì)促排卵方案及授精方式進(jìn)行統(tǒng)一或分層分析，研究結(jié)論可能存在一定的偏倚。未來需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步完善研究設(shè)計(jì)加以探討，以及對(duì)出生嬰兒進(jìn)行長(zhǎng)期的追蹤隨訪。

綜上所述，對(duì)于地貧高發(fā)地區(qū)行ART助孕的人群，行常規(guī)地貧基因檢測(cè)還是有一定必要的，能盡早篩選出基因異常的患者并及時(shí)干預(yù)。對(duì)于輕型地貧的患者，男方或女方輕型地貧均不會(huì)明顯影響ART的妊娠結(jié)局，但是女方為輕型地貧時(shí)有增加不良妊娠結(jié)局的趨勢(shì)。因此，建議在孕期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血紅蛋白及鐵蛋白水平的變化，及時(shí)進(jìn)行評(píng)估和處理，以保證孕婦身體健康及胎兒的正常發(fā)育。