黃一勇 楊戈 劉堯喜 譚謙 劉昆 朱光輝 唐進 梅海波

湖南省兒童醫(yī)院骨科，長沙 410007

先天性脛骨假關節(jié)（congenital pseudarthrosis of tibia，CPT）是一種罕見的小兒骨科疾病，發(fā)病率為1／250 000 ～1／140 000［1］。 主要臨床特征為：出生時即有脛骨缺損，形成假關節(jié)；或出生時伴有先天性脛骨前弓畸形，外傷后骨折不愈合而形成假關節(jié)［2］。 自1891 年Paget 首次報道CPT 以來，距今已有100 余年的歷史，但其病因及發(fā)病機制仍不明確［3-5］。 CPT 由于病灶假關節(jié)處難以實現(xiàn)骨性愈合而成為臨床治療的難點，通常骨的發(fā)育和骨折的愈合與間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化以及成骨細胞、破骨細胞的活性密切相關［6-7］。 有研究表明，CPT 患兒假關節(jié)部位骨髓中MSCs 的成骨能力比正常人差，且其假關節(jié)部位破骨細胞活性增強，提示CPT 的發(fā)生可能與假關節(jié)局部骨代謝異常有關［8-10］。

外泌體是細胞分泌的一種直徑30 ～00 nm 的小囊泡，其中包含多種蛋白質，這些蛋白質在免疫調節(jié)、細胞遷移以及介導細胞分化等方面起著重要的作用［11］。 近年來血清來源的外泌體（serum-derived exosomes，SDEs）在骨重建領域引起了廣泛關注，并證明其與一些骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關，如骨質疏松癥或成骨不全［12］。 本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，CPT 患兒血清來源外泌體具有抑制成骨、促進破骨代謝的能力，提示CPT 血清外泌體中包含的蛋白分子與正常兒童存在差異［13］。

雖然SDEs 對骨代謝的影響越來越受到重視，但至今尚沒有關于CPT 患兒和正常兒童SDEs 蛋白質組學的研究。 本研究使用液相色譜串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS／MS）結合TMT 標記定量技術，進行CPT 患兒和正常兒童的SDEs 蛋白質譜分析，尋找CPT 和正常兒童SDEs 之間的差異蛋白，并使用生物信息學方法對差異蛋白進行分析，以期為CPT 的病理生物學機制研究奠定基礎。

材料與方法

一、研究對象和樣品處理

采集湖南省兒童醫(yī)院2017 年6 月至2019 年8月收住院的6 例合并I 型神經纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1）的Crawford Ⅳ型CPT 患兒（男3例，女3 例，平均年齡18.5 個月）和4 例正常兒童（男3 例，女1 例，平均年齡37. 5 個月）靜脈血。CPT 的診斷基于臨床表現(xiàn)和影像學特征［14］。 將獲取的靜脈血即刻在4℃離心機中以5 000 rpm／min離心5min，取上清液于凍存管中放于-80℃凍存以備后續(xù)研究。 本研究經湖南省兒童醫(yī)院倫理委員會批準（編號：HCHLL-2019-36），且獲得患兒父母知情同意。

二、血清中外泌體分離

先將全血樣品離心（4℃，3 000xg，30 min），取上清液（即血清）。 然后使用等體積的PBS（phosphate buffered saline）稀釋血清，并用0.22 μm 篩網過濾后再次離心（4℃，25 000 xg，90 min），取上清液，之后加入ExoQuick-TC agentia（System Biosciences，Palo Alto，CA，USA），于4℃環(huán)境下過夜后離心（4℃，1 500 xg，30 min），去除上清液后即可獲得外泌體。 用200 μL 的PBS 重懸后，將所有外泌體儲存在-80℃環(huán)境下或用于進一步的研究［13］。

三、外泌體中蛋白提取、酶解及TMT 標記

將外泌體從-80℃冰箱取出，離心（4℃，12 000 xg，15 min）后取上清液，并用0.22 μm 微孔濾膜過濾上清液，再用PTM 公司生產的PTM-EVs 試劑盒分離外泌體。 加入終濃度為8 mol／L 的Urea 以及蛋白酶抑制劑超聲裂解，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。 加二硫蘇糖醇調節(jié)蛋白濃度為5 mmol／L，并還原30 min（56℃）。 再加入碘代乙酰胺調節(jié)蛋白濃度至11 mmol／L 并孵育15 min（室溫、避光），再將樣品的尿素濃度稀釋至2 mol／L 以下。 蛋白溶液中加入胰酶（胰酶與蛋白的質量比為1 ∶50）后，37℃酶解過夜。再按1 ∶100 的胰酶與蛋白質量加入胰酶，37 ℃酶解4 h。 酶解之后的肽段用Strata X C18 （Phenomenex） 除鹽、真空冷凍干燥，再以0.5 mol／L TEAB 溶解肽段，然后按照TMT 試劑盒操作說明標記肽段（標記試劑解凍后用乙腈溶解，與肽段混合后室溫孵育2 h，標記后的肽段混合后除鹽，真空冷凍干燥）。 肽段用Agilent 300Extend C18 進行反向濃縮、真空冷凍干燥，并用液相色譜流動相A 相（0.1%甲酸和2% 乙腈的水溶液）溶解后使用EASY-nLC 1200 超高效液相系統(tǒng)進行分離。

四、Q Exactive HF-X 質譜分析

分離后的肽段被注入NSI 離子源中電離，然后使用Q Exactive HF-X 質譜分析儀進行分析。 設置離子源電壓為2.0 kV，并使用高分辨Orbitrap 檢測和分析肽段母離子及其二級碎片。 設置掃描范圍（一級質譜為350 ～1 600 m／z，二級質譜則固定起點為100 m／z）和掃描分辨率（一級質譜為120 000，二級質譜為30 000）。 使用數據依賴型掃描（DDA）程序采集質譜數據。

五、生物信息學分析

本研究使用Maxquant （v1.5.2.8）處理質譜數據，并在Homo_sapiens_9606_SP_20190513（20422條序列）數據庫中進行檢索。 以1.3 倍為差異表達變化閾值，以統(tǒng)計學檢驗P＜0.05 為顯著性閾值，得到差異表達蛋白，并對差異蛋白進行以下分析。

（一）GO 注釋及富集分析

Gene Ontology（GO）即基因本論，主要從生物進程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）三個不同角度對差異蛋白進行分析。 本研究運用GO 分析從上述3 個方面對差異蛋白進行注釋，并行GO 富集分析。

（二）KEGG 通路富集分析

KEGG 是連接已知分子間相互作用的信息網絡，如代謝通路、復合物、生化反應。 KEGG 途徑主要包括：代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、人類疾病、藥物開發(fā)等。 為確定最明顯的差異途徑，本研究對差異蛋白進行KEGG 通路富集分析。

（三）DisGeNET 富集分析

DisGeNET（即疾病相關的基因與突變位點數據庫）是一個收集人類疾病相關基因的數據庫，可用于分析人類疾病的分子基礎、疾病基因的性質分析、疾病候選基因的驗證等。 本研究對差異蛋白進行DisGeNET 富集分析，識別差異蛋白與其他疾病的關系。

（四）蛋白互作網絡分析

蛋白互作網絡（protein interaction network，PPI network）分析有助于從系統(tǒng)的整體的角度研究生物分子機制、原理和預測蛋白質相互間功能影響。 本研究采用Metascape 對差異蛋白進行分析，并使用MCODE 算法識別密集連接的網絡聚類。

結 果

一、血清外泌體的蛋白質組學概況

本研究一共鑒定到1 417.0 個可定量蛋白（至少一個比較組有定量信息）。 以1.3 倍為差異表達變化閾值，以統(tǒng)計學檢驗P＜0.05 為顯著性閾值，共得到410 個差異蛋白。 CPT 患兒與正常兒童相比，有121 個蛋白表達發(fā)生上調，289 個蛋白表達發(fā)生下調。

二、GO 注釋

GO 注釋結果表明，差異蛋白涉及的生物進程包括細胞過程、單生物過程及生物調節(jié)等。 在細胞組成中，差異蛋白主要存在于細胞、細胞器及胞外區(qū)等。 在分子功能上，差異蛋白明顯集中在分子結合和分子催化活性2 個區(qū)域。 見圖1。

圖1 差異蛋白在生物學過程、細胞組成和分子功能的主要GO 注釋結果 橫軸為蛋白數量，縱軸為GO 術語Fig.1 Main GO annotation results of differentially expressed proteins during biological process，cellular component and molecular function

三、KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析表明，補體系統(tǒng)、阿爾茨海默病、氧化磷酸化是富集最明顯的3 個途徑。 圖2列出了最顯著富集的前20 個分類的結果。

圖2 差異表達蛋白在KEGG 通路中富集分布氣泡圖 橫軸為log 2 富集倍數（以2 為底的對數變換），縱軸為通路名稱，圓圈大小代表蛋白數目，顏色表示富集程度Fig.2 KEGG pathway enrichment of differentially expressed proteins

四、DisGeNET 富集分析

DisGeNET 富集分析結果表明，在排名前五的疾病中，有3 種疾病與骨質疏松癥有關。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，差異蛋白中與骨質疏松有關的蛋白共有22個。 表1 列出了所有與骨質疏松相關的差異蛋白及差異蛋白所對應的基因名稱和注釋。

表1 與骨質疏松相關的22 個差異蛋白及其對應的基因名稱和注釋Table 1 The Serial numbers of 22 differentially expressed proteins，genes and its annotations associated with osteoporosis

五、蛋白互作網絡分析

本研究使用Cytoscape 軟件制作了差異蛋白PPI 圖，并對參與糖酵解／糖異生模塊的差異蛋白進行了分析（圖3）。 根據MCODE 分析顯示，有11 種MCODE 組分蛋白質密集連接（表2），糖酵解／糖異生模塊為差異蛋白富集模塊之一。

圖3 糖酵解／糖異生相關蛋白的相關作用圖Fig.3 Protein-protein interaction map of glycolysis／gluconeogenesis related proteins

表2 應用MCODE 算法識別11 個密集連接的網絡聚類Table 2 Eleven densely connected network clusters identified through MCODE algorithm

討 論

本研究對CPT 患兒和正常兒童的血清來源外泌體內蛋白質進行鑒定，共得到410 個差異表達蛋白。 與正常兒童相比，CPT 患兒有121 個蛋白表達上調，有289 個蛋白表達下調。 差異蛋白的KEGG富集分析結果表明，補體系統(tǒng)是差異蛋白富集最明顯的通路。 補體主要在肝臟合成，然后釋放入血。一些肝外的組織和細胞（如成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞）也可以在相應部位產生補體成分。 補體在骨骼的生長、修復過程中起著重要的作用。 有研究表明，在骨的生長發(fā)育過程中，生長板中的C3、C5、C9 在生長板的軟骨骨化過程中起重要作用［15］。動物研究表明，缺乏C3 和C5 會導致骨的生長板變厚，使軟骨骨化延遲。 補體除對軟骨細胞有影響外，還影響間充質干細胞的募集和增殖分化，進而影響骨的發(fā)育和修復。 本研究中發(fā)現(xiàn)差異蛋白中有C3、C5、C9 等補體的存在，表明補體系統(tǒng)紊亂可能與CPT 的發(fā)生有關。

PPI 富集分析顯示，糖酵解和糖異生（即MCODE 5）為差異蛋白富集過程之一，糖酵解和糖異生是細胞獲得能量的兩個重要途徑，提示CPT 可能存在能量代謝異常。 在生物體中，糖的氧化分解主要有3 條途徑：糖的有氧氧化、糖酵解和磷酸戊糖途徑，其中糖酵解是所有生物體進行葡萄糖分解代謝所必須經過的共同階段。 最近有研究表明，間充質干細胞的能量代謝異常會影響其增殖及分化，進而導致成骨細胞減少，造成骨質疏松［16］。 已有研究表明CPT 病變骨膜中干細胞的增殖分化異常［17］。本研究發(fā)現(xiàn)糖酵解和糖異生均為差異蛋白的PPI 富集過程，提示CPT 可能存在間充質干細胞的能量代謝異常。

DisGeNET 分析發(fā)現(xiàn)，DisGeNET 富集的前5 種疾病中，有3 種疾病與骨質疏松癥有關。 骨質疏松的原因復雜，其中干細胞的增殖分化減弱是其機制之一［18］。 2008 年，Cho 等［9］對7 例先天性脛骨假關節(jié)合并NF1 患兒的病變骨膜和3 例對照組患兒的正常脛骨骨膜進行了研究，發(fā)現(xiàn)病變骨膜中的細胞在一定程度上保持間質細胞系細胞表型，但是沒有在BMP 誘導下產生成骨分化。 2016 年，Madhuri等［8］研究發(fā)現(xiàn)CPT 患兒病變骨膜中的MSCs 分化潛能及成骨潛能較正常兒童差。 2018 年，Dilogo 等［19］通過對6 例CPT 患兒髂骨骨髓及假關節(jié)病變部位MSCs 進行對比研究發(fā)現(xiàn)，與髂骨骨髓相比，CPT 病變部位的MSCs 更容易衰老。 由于CPT 病變骨膜中MSCs 的成骨能力較正常兒童差，Tikkanen 等［17］在2010 年將含有MSCs 的培養(yǎng)液置于假關節(jié)局部來治療CPT，并取得了成功。 因此，CPT 病變骨膜中干細胞的增殖分化異常可能是其發(fā)病機制之一。

綜上所述，補體系統(tǒng)紊亂和細胞能量代謝異?？赡苁荂PT 的潛在發(fā)病機制。 本研究為探索CPT的發(fā)病機制提供了新的思路，但仍存在一定的局限性。 首先，本研究不僅鑒定出補體和能量代謝的相關差異蛋白，還發(fā)現(xiàn)許多其他差異蛋白（如氨基酸代謝相關蛋白），這些蛋白也可能與CPT 的發(fā)生有著重要的關系；另外，本研究選擇的研究對象是血清外泌體，如選擇組織外泌體可能更具有實際意義；第三，本研究采用初級的生物信息學分析方法，且未進行組織學驗證，研究結論可能存在一定的偏差。 對于上述不足，我們將在下一步的研究中去彌補。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明文獻檢索為黃一勇、劉堯喜，論文調查設計為黃一勇、楊戈、朱光輝、梅海波，數據收集與分析黃一勇、劉堯喜，論文結果撰寫為黃一勇、楊戈，論文討論分析為黃一勇、劉堯喜、譚謙、劉昆、朱光輝、唐進、楊戈、梅海波