張?zhí)煊?王舒琪 任柳杰 李辰龍 姚文娟

耳蝸是聽覺系統(tǒng)實現(xiàn)感音換能的核心器官，可對聲音信息進行頻率分離、主動放大等預處理，兼具寬頻率和強度范圍聲音感知、高靈敏低耗能的優(yōu)點。耳蝸精巧的結構、特殊的組織材料特性是其功能實現(xiàn)的基礎?；啄さ男胁ìF(xiàn)象是耳蝸進行實時頻率分離的載體；外毛細胞電致運動則主動放大行波響應，是提高耳蝸敏感性的關鍵。自1961年Békésy提出行波理論，開創(chuàng)實驗聽力學以來，大量學者致力于研究基底膜振動特征、外毛細胞聽覺放大等問題，以揭示耳蝸高靈敏、寬頻率感音機制，形成了耳蝸力學這一多學科交叉研究的熱點領域。行波現(xiàn)象的實驗測量是耳蝸力學的關鍵研究手段，測量技術的革新促成了耳蝸感音機制研究的若干次重大突破。

行波測量(基底膜及Corti器振動測量)是耳蝸感音機制研究的最直接方法，分為振動模式(pattern)測量法和點測量法兩類。振動模式測量法需要大范圍打開耳蝸，以觀察耳蝸基底膜區(qū)域的振動形態(tài)。Békésy即采用該方法并首次發(fā)現(xiàn)行波現(xiàn)象[1]，但由于振動模式測量法需要破壞耳蝸正常結構，同時Békésy采用離體標本作為實驗對象，因而他測得的基底膜振動呈線性，其調諧響應弱于聽神經，據(jù)此Békésy認為蝸后(如神經)存在進一步的頻率銳化，即所謂“第二濾波器”。點測量法僅測量基底膜上某一點的振動，耳蝸損傷較小，是目前耳蝸力學研究的主流方法。二十世紀七十年代發(fā)展的莫斯鮑爾技術(M?ssbauer technique)是第一個應用于基底膜測量的高精度、高靈敏度的技術手段。利用該技術Rhode發(fā)現(xiàn)基底膜振動具有壓縮非線性，該發(fā)現(xiàn)啟示并引領了耳蝸主動機制研究。上世紀八十至九十年代，激光多普勒測振儀(laser doppler vibrometer，LDV)以其非接觸式測量、高精度和高空間分辨率的優(yōu)點，加之商業(yè)化LDV的廣泛應用，成為中、內耳力學研究的最重要測量技術之一。但是，應用LDV進行行波測量需要在耳蝸骨壁鉆孔以暴露基底膜，仍會影響耳蝸正常生理活動，干擾實驗結果。盡管LDV可實現(xiàn)耳蝸蝸底高頻區(qū)基底膜振動測量，但對于蝸頂?shù)皖l區(qū)的測量存在困難。近年來體積相干光斷層掃描測振技術(volumetric optical coherence tomography vibrometry，VOCTV，也稱相敏OCT，phase-sensitive OCT)以其高空間分辨率、穿透式測量的優(yōu)點，可部分彌補上述技術的不足，尤其是在耳蝸低頻區(qū)測振、Corti器微觀結構振動測量方面取得突破性進展[2～4]。

本文闡述自Békésy以來，耳蝸力學領域行波測量技術的沿革、各自優(yōu)缺點及主要研究成果。這些技術和成果推動了行波理論的不斷完善，即對耳蝸感音力學機制的深入理解。如何開發(fā)和應用新技術進一步揭示耳蝸高效感音的機制，這些新技術及成果又如何應用于臨床實踐，是未來耳蝸力學研究的兩大主題。

1 莫斯鮑爾技術

莫斯鮑爾技術應用原子核輻射的γ射線無反沖共振吸收的莫斯鮑爾效應。原子核共振過程受能量調節(jié)，震源運動能引起可檢測的多普勒頻移。利用該效應可實現(xiàn)高精度的振動測量。

Rhode(1971)成功利用莫斯鮑爾測振技術在活體松鼠猴耳蝸中觀察到基底膜振動具有壓縮非線性特性。Sellick(1982)及Le Page(1980)等在此基礎上，進一步發(fā)現(xiàn)基底膜具有尖銳的調諧反應，該反應與聽神經反應一致，與Békésy測量結果不同。綜合Kemp(1978)發(fā)現(xiàn)的耳聲發(fā)射現(xiàn)象，否定了第二濾波器假說，證明“耳蝸主動機制”的存在，是耳蝸力學研究的又一里程碑式突破。

然而莫斯鮑爾技術具有一定的局限性，如：①測量需在基底膜上放置放射源，改變基底膜質量，造成基底膜損傷，導致測試時間窗較窄，影響測試結果; ②γ射線具有極強的非線性，在測量過程中會對基底膜振動的諧波成分造成數(shù)據(jù)干擾; ③測量時需要使用放射物質，難以推廣應用。隨后莫斯鮑爾技術被基于干涉原理的激光多普勒測振技術取代。

2 激光多普勒測振技術

激光多普勒測振(LDV)技術應用了光學多普勒效應和光束干涉原理。由于激光具有良好的線性特性及對微小速度變化的高度敏感性，LDV成為耳力學研究的又一理想技術，其測量精度可達到納米級。由于中、內耳結構微小、復雜，在振動測量研究中，LDV常需與聲激勵系統(tǒng)、隔振臺及解剖顯微鏡耦合使用。

Tonndorf和Khanna(1968)利用LDV技術首次實現(xiàn)鼓膜振動的測量。但受激光質量、光學元件的制造工藝和信號處理等因素的影響，早期LDV無法進行耳蝸基底膜振動的精確測量。1982年Khanna對激光光源進行改進，設計了激光零差測振系統(tǒng)，首次實現(xiàn)LDV基底膜振動的測量。

大部分基于LDV的行波振動測量部位多局限于基底膜高頻區(qū)?？傮w而言，不同物種耳蝸高頻區(qū)基底膜響應規(guī)律相似，即壓縮非線性特征在最佳頻率處顯著，其余位置呈線性，再一次證明基底膜響應具有極精細的頻率選擇性。利用LDV對蝸頂?shù)皖l區(qū)基底膜振動測量較為困難，有限的研究結果提示低頻區(qū)基底膜壓縮非線性特性可能不如高頻區(qū)敏銳。但進行低頻區(qū)基底膜振動測量時需要對前庭膜開孔，導致內外淋巴液混合，破壞耳蝸正常生理環(huán)境，對毛細胞功能造成影響。而Khanna(1989)通過研究外毛細胞受損時基底膜調諧變化，證明正常活性的外毛細胞是耳蝸實現(xiàn)頻率分離的基礎，因此低頻區(qū)耳蝸響應的LDV測量結果不足以反映正常生理狀態(tài)下的基底膜調諧規(guī)律。

除對基底膜響應的壓縮非線性特征進一步探究外，利用LDV還可對蝸隔各部分的振動形式分別進行測量。由于Corti器坐落于基底膜上，在耳蝸力學研究中兩者密不可分，有時將它們視為整體，統(tǒng)稱為蝸隔(cochlear partition)。蝸隔的振動極為復雜，以徑向為主，在Corti器附近振動方向垂直網狀板。Hensen細胞區(qū)振幅最大，但相位稍滯后于外毛細胞區(qū)。Greenwood(1996)對不同物種耳蝸各回基底膜振動進行測量，通過對比低、中、高頻區(qū)基底膜振動特點，總結基底膜長度和特征頻率對數(shù)的線性關系，對兩棲類、哺乳類動物擁有超寬聽覺動態(tài)范圍(強度/頻率)的機制進行探究，通過分析哺乳類動物聽覺演化過程中耳蝸聲音頻率分析功能逐漸加強的原因，更進一步的明確了頻率辨別的部位機制及毛細胞在其中所起的重要作用。

由于LDV為10～20 dB SPL聲刺激下基底膜響應的測量提供可能，關于耳蝸主動機制的研究取得新的突破性認識，即證偽“逆向行波學說”。既往學者多認為耳聲發(fā)射現(xiàn)象源于基底膜的逆向行波，2004年Ren(任田英)對于耳聲發(fā)射現(xiàn)象進行實驗測量，實驗中僅觀測到基底膜的順向行波，據(jù)此否定了逆向行波假說；盡管目前學界對此結果仍存有爭議，由于Ren在研究中觀察到鐙骨提前振動的現(xiàn)象，據(jù)此Ren提出耳聲發(fā)射的主要途徑是耳蝸液體中的壓力波。此外，有學者對LDV進行技術改良，如Cooper(1999)改進了反射光與入射光分離的技術；Jacob(2009)將LDV與激光掃描共聚焦顯微鏡的耦合，為耳蝸微機械力學的研究提供更好的穩(wěn)定性和可操作性。

同樣，LDV技術也存在某些不足，如測量時必須在耳蝸骨壁上開孔(約0.2 mm)以暴露待測基底膜，因此需要使用玻璃片封閉窗口等方法減少內外淋巴液的流失，即便如此耳蝸開孔仍會造成內外淋巴液混合和毛細胞損傷[5]，影響測量結果，限制了內耳病理狀態(tài)下基底膜振動的研究。

3 體積相干光斷層掃描技術

體積相干光斷層掃描測振技術(VOCTV)是OCT的改進。OCT應用寬帶光的干涉現(xiàn)象進行成像，通過測量光束發(fā)射至反射的延擱時間來定位光的反射深度，使不同深度組織結構在圖像上進行映射和解析(Ren,2001)。臨床上OCT已廣泛用于多種器官如眼球、冠狀動脈、支氣管、食管和皮膚的無創(chuàng)及微創(chuàng)診斷成像[6,7]。因OCT可清晰地對耳蝸各亞顯微結構如蓋膜、前庭膜及Corti器進行成像和觀測[2,3,8]，滿足對耳蝸基底膜各結構振動的空間特征和行波的進一步研究需要，參考LDV測振原理，經改良探測光束、數(shù)據(jù)采集設計及運算方法，制成具有多普勒測振功能的VOCTV，可對耳蝸基底膜的振動進行穿透式、非接觸的無創(chuàng)測量。

Choudhury于2006年首次成功利用VOCTV對開放的豚鼠耳蝸基底膜振動進行測量。同年Hong(2006)及其團隊亦報道利用VOCTV實現(xiàn)離體耳蝸基底膜、蓋膜、前庭膜及外毛細胞的振動測量。早期的VOCTV測振研究受信噪比及穿透深度限制，實驗對象以離體耳蝸為主，后經儀器改進，在體耳蝸基底膜振動的測量研究逐漸開展。VOCTV技術使在保持耳蝸完整狀態(tài)下對基底膜振動的測量成為可能，消除了此前耳蝸開窗術對基底膜功能和狀態(tài)的影響，成為耳蝸力學研究技術的一個重要突破[5]。利用VOCTV對耳蝸低頻區(qū)基底膜振動測量的研究結果提示嚙齒類動物耳蝸低頻區(qū)壓縮非線性程度較低，具有低通特性，頻率選擇性不如高頻區(qū)敏銳[9～12]。此外，VOCTV的分辨率滿足了對耳蝸各亞顯微結構相對運動觀測的需要，實現(xiàn)了對各結構間聲波傳遞規(guī)律的探索，如蓋膜行波現(xiàn)象的觀測、蓋膜與前庭膜間的相對運動[3,8]、網狀板和基底膜間的相對運動，揭示Corti器的濾波原理和耳蝸主動機制[8,13,14]，進一步證實外毛細胞在其中所起的重要作用[15]。為探究各結構三維空間上的運動特性，Lee等團隊利用基因敲除技術制造前庭膜、蓋膜及外毛細胞纖毛連接松解的模型小鼠，實現(xiàn)了對Corti器及前庭膜軸向運動的測量[3]。

由于VOCTV測量保持耳蝸的完整性，使內耳病理狀態(tài)下基底膜振動測量成為可能，對于內耳病理狀況的評估具有重要的應用前景。Xia(2018)通過基因敲除技術制造第三列外毛細胞缺失小鼠，對該病理狀態(tài)下Corti器振動方式進行探究，證實了VOCTV技術在耳蝸病理機制探究中的重大潛力。

VOCTV技術的主要不足是穿透深度有限，這限制了VOCTV在耳蝸力學振動測量領域的進一步應用。VOCTV的成像空間分辨率和穿透深度相互制約，如橫向分辨率為10 μm時(小鼠Corti器高度約100 μm)，最新的VOCTV穿透深度僅為1.5 mm(表1歸納了目前研究中常用的VOCTV儀器型號、穿透深度及分辨率)。因此，VOCTV在體基底膜測振的實驗對象多為耳蝸骨質較薄的嚙齒類動物[3,4,8～11]，且需耦合使用如轉角鏡等一些輔助機械[16]。目前，VOCTV技術仍在不斷改進發(fā)展中，其分辨率和穿透深度都有望進一步提高。

表1 研究中常用的VOCTV儀器基本參數(shù)

4 展望

自Békésy提出行波理論獲得諾貝爾醫(yī)學與生理學獎(1961年)以來，隨高精度測量技術的發(fā)展，研究者對耳蝸的機械特性及主動增益有了進一步的認識，LDV與VOCTV在內耳力學振動測量領域中的應用更成功地對生理狀態(tài)下耳蝸感音機制進行深入解析，有望在未來實現(xiàn)病理狀態(tài)下耳蝸響應的研究，協(xié)助臨床明確內耳疾病的病理機制，啟發(fā)新的診斷技術研發(fā)。未來仍然需要對基底膜行波現(xiàn)象的高精度和高空間分辨率測量、對Corti器亞顯微結構的相互作用與影響等進行分析。①Corti器的三維振動測量。Corti器的復雜三維運動的測量有助于對比分析Corti器各部分振動響應差異，探究毛細胞在耳蝸頻率辨別中所起的作用。進行Corti器三維運動的觀測需對基底膜各部分結構進行較清晰的成像，以便在圖像中進行辨認，因此對VOCTV的分辨率要求較高。現(xiàn)有的VOCTV不能滿足測量需要，需對測量儀器進行改進與完善，目前，對Corti器的三維運動觀測尚處于起步階段[19]。②纖毛-蓋膜兩者間的相對運動。蓋膜下液體的流動時可形成剪切力，刺激外毛細胞纖毛，引起耳蝸內力-電信號的轉換。外毛細胞電致運動是耳蝸主動機制的關鍵。但對于三排外毛細胞所司功能差異、聲刺激引起外毛細胞活化的具體機制及蓋膜在耳蝸主動放大功能中所起到的作用尚待進一步探討[20～23]，以建立內耳疾病中外毛細胞纖毛的損傷情況和聽力損失程度二者間的聯(lián)系，對聽力損失進行詳細分類，使患者可以接受更有針對性的治療，恢復或保留殘存聽力，改善疾病預后。但目前尚無可以進行上述研究的有效手段，有賴于未來新型測量儀器的開發(fā)。