宋海杰，張彥華，張 娜，陶藝慶，吳 星，司素錦，田亞東 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院 河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

非洲豬瘟病毒(Africa swine fever virus，ASFV)是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，可以在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中完全或部分復(fù)制，并具有自我修復(fù)能力[1]。在非洲、亞洲和歐洲廣泛流行[2]，對養(yǎng)豬生產(chǎn)、生豬產(chǎn)業(yè)鏈及社會經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了重大影響[3]。近幾年其跨地區(qū)傳播風(fēng)險進(jìn)一步升級，尤其對歷史上從未發(fā)生過的地區(qū)，如2018年中國、比利時被侵襲[4-5]，2019年越南、老撾、緬甸、菲律賓[6]被侵襲，2020年德國[7]、朝鮮[8]、韓國[9]、印度[10]被侵襲，2021年馬來西亞[11]被侵襲，其流行趨勢和傳播風(fēng)險有增無減。ASFV通過多種途徑傳播，包括直接接觸受感染的家豬或野豬[12]以及間接接觸污染物及食用受污染的飼料、泔水、飲水等等[13-14]。由于目前仍沒有安全有效的疫苗[15-17]，養(yǎng)豬業(yè)主要通過嚴(yán)格的生物安全措施來防控非洲豬瘟(ASF)[18]，通過控制入場的動物、人員、物料、車輛、蟲害等[19]風(fēng)險來防止病原進(jìn)入農(nóng)場。然而，通過對2013—2014 年豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)在整個北美的侵入和傳播的研究，推測飼料可能是一種污染物，飼料供應(yīng)鏈可能有助于傳播病毒[20]。也是基于PEDV在北美的流行，改變了養(yǎng)豬生產(chǎn)者和飼料制造商的思維，進(jìn)而更加關(guān)注將生物安全防控擴(kuò)展到飼料及飼料相關(guān)鏈條,最近的一些研究也顯示飼料在ASFV的傳播上發(fā)揮著重要作用[21-23]。目前中國的養(yǎng)豬企業(yè)絕大多數(shù)在使用商業(yè)飼料，商業(yè)飼料在進(jìn)入豬的口中之前，需經(jīng)歷的過程包括：飼料廠采購原料、飼料廠加工原料成為商品飼料、商品飼料運(yùn)輸?shù)轿锪髦修D(zhuǎn)站、物流中轉(zhuǎn)后運(yùn)輸?shù)斤暳辖?jīng)銷商、經(jīng)銷商運(yùn)送飼料至養(yǎng)殖場，整個過程中如果飼料出現(xiàn)了污染，都會成為ASFV傳播的風(fēng)險[24-25]。因此，了解飼料原料、飼料加工環(huán)境及運(yùn)輸過程中的ASFV傳播風(fēng)險至關(guān)重要，基于此，現(xiàn)重點(diǎn)闡述以上幾個方面的研究進(jìn)展，以期為我國豬場生物安全體系建設(shè)、阻斷ASF傳播、健全豬場ASF防控提供參考。

1 ASFV在飼料原料中的存活及傳播風(fēng)險

飼料原料作為商業(yè)飼料重要的組成成分，其受到污染的風(fēng)險直接關(guān)系到商品飼料的安全。ASFV具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，血液中的病毒在4℃以下可持續(xù)存活超過525 d，在冷凍的肉、皮膚和脂肪、內(nèi)臟中能分別持續(xù)存活1 000，300，155 d[26]。動物源性副產(chǎn)品如豬血漿蛋白粉、肉骨粉，已普遍被認(rèn)為是豬病毒污染和傳播的潛在高風(fēng)險。WEN等[27]對遼寧某公司生產(chǎn)的20批及河北某公司生產(chǎn)的1批豬血漿蛋白粉進(jìn)行檢測，均檢測到了ASFV核酸陽性，并進(jìn)行了基因測序，發(fā)現(xiàn)和Pig/HLJ/2018具有相同的基因組序列，雖然無法從檢測的血漿蛋白粉中分離出活病毒，但這并不意味著國內(nèi)使用的豬血漿蛋白粉中ASFV都已被滅活。盡管ASFV在受污染的豬肉及其產(chǎn)品和血液中的高穩(wěn)定性已經(jīng)得到證實(shí)和重視，但其在植物性飼料原料中的穩(wěn)定性最近才逐漸得到認(rèn)可，尤其是谷物類飼料原料，在種植、收獲、加工及后加工過程中都可能存在污染的風(fēng)險。例如大田作物在收獲前如果接觸過受感染的野豬、收獲后干燥的谷物在道路上晾曬而被污染的車輛碾壓、作物產(chǎn)區(qū)的土壤或灌溉水被來自野豬的尸體/糞便或受感染家豬的糞便中的ASFV污染，則谷物可能會受到污染[28]。研究也已表明ASFV在一些常見谷物上可以存活一定的時間[29]。STOIAN等[29]通過30 d的模擬飼料原料跨大西洋運(yùn)輸，并對不同原料接種了ASFV，發(fā)現(xiàn)ASFV在普通豆粕、有機(jī)豆粕、豆餅、膽堿、豬肉腸衣及全價飼料上的平均半衰期分別為9.6，12.9，12.4，11.9，13.1，14.2 d，相較于普通基質(zhì)中的半衰期，飼料中病毒的半衰期更長，也反映出飼料基質(zhì)能夠提供增加ASFV穩(wěn)定性的環(huán)境。目前尚未有研究來確定ASFV是否能在商品飼料中使用的各種礦物質(zhì)中存活。然而，從感染ASFV的野豬尸體埋葬地點(diǎn)收集的土壤樣本中能檢測到ASFV的DNA[30]。此外，雖然土壤的pH值、結(jié)構(gòu)和溫度會影響ASFV在不同土壤中的穩(wěn)定性，但ASFV在無菌沙子中仍能存活3周以上，在沙灘上能存活2周，在庭院的土壤中能存活1周[31]。因此檢測飼料原料以防控ASF暴發(fā)至關(guān)重要，也有研究機(jī)構(gòu)開發(fā)了使用飼料粉塵作為飼料中 ASFV是否遭受污染的檢測診斷工具[32]。

2 ASFV在飼料加工及運(yùn)輸中的傳播風(fēng)險

我國商業(yè)飼料的銷售主要采用分銷方式，了解飼料場加工環(huán)境的污染至關(guān)重要。研究證實(shí)了Georgia 2007毒株通過飼料感染豬只的最小劑量為104TCID50，通過飲水的最小感染劑量為100TCID50，且隨著飼料和液體劑量的增加，感染的可能性增加[33]。與水源相比，飼料可能構(gòu)成更大的威脅，因?yàn)轱暳陷斔秃筒墒呈且环N高頻率事件，并且隨著接觸次數(shù)的增加，通過受污染飼料感染的可能性會急劇增加[33]。有研究對越南的1個飼料廠進(jìn)行采樣檢測，共采集飼料廠中的環(huán)境拭子202份，其中1份(地面樣品)ASFV核酸陽性，陽性率0.5%，采集飼料及飼料配料52份，檢測結(jié)果均為陰性；另一項(xiàng)研究于2018年11月到2019年2月ASFV流行期間，對中國的3家商業(yè)性飼料廠進(jìn)行了ASFV的PCR采樣檢測，在所有5 646份全價料樣品中陽性率為0.5%～1.2%，5 364份飼料原料(包括玉米、小麥、大米、豆粕、面粉、麩皮、礱糠等樣品)中陽性率為0.2%～1.8%。在原料陽性樣品中，1份來自玉米，4份來自大米，6份來自麩皮，3份來自豆粕[34]。

在一項(xiàng)評估受ASFV污染后飼料批次間交叉污染及對環(huán)境影響的研究顯示，在污染批次的飼料加工完成后，后續(xù)4批飼料仍能檢測到ASFV陽性，且在和飼料直接接觸表面(如混合機(jī)、提升機(jī))、小于1 m的非接觸表面(如混合機(jī)旁邊的墻壁)、大于1 m的非接觸表面(如距離混合機(jī)較遠(yuǎn)的墻壁)、移動的表面(如人員的鞋底)等環(huán)境樣品中均能檢測到ASFV 陽性，且移動表面檢出的ASFV的DNA量最高[22]，這反映出ASFV一旦進(jìn)入飼料廠環(huán)境，傳播風(fēng)險便不僅限于某批次污染的飼料，而是可能會持續(xù)存在于多批次的飼料中，且進(jìn)入飼料廠環(huán)境中的病毒會很快擴(kuò)散，污染生產(chǎn)設(shè)施及周圍環(huán)境，而人員的流動可以顯著促進(jìn)ASFV在飼料廠環(huán)境中的傳播。在之前對PEDV傳播的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)移動的物體(如飼料、卡車)及人員也能促進(jìn)病毒的傳播[35]。此外，如果懷疑飼料廠環(huán)境中存在病毒污染，可以通過環(huán)境拭子進(jìn)行檢測，在ASFV暴發(fā)的區(qū)域，也可將環(huán)境拭子采樣檢測納入飼料廠安全管理中，以了解飼料廠環(huán)境的潛在污染情況，便于及時采取措施。

車輛是飼料運(yùn)輸過程中最容易被污染的，JORDAN等[36]從飼料廠經(jīng)過清洗消毒后的生豬運(yùn)輸車輛上采集了112個拭子樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)駕駛室內(nèi)部表面采集的40個樣本中有4個(10.0%)為陽性，從車輛外部表面采集的72個樣本中，包括豬接觸表面和車輪中沒有陽性，車輛整體平均高達(dá)13.6%的陽性率。通過北美暴發(fā)PEDV原因的研究，研究者開始意識到運(yùn)輸過程中的飼料與疾病傳播之間有著潛在聯(lián)系，受污染的飼料及包裝袋可能是美國PEDV暴發(fā)的根本原因[20]。此后，獸醫(yī)、養(yǎng)殖場、飼料廠開始致力于使用預(yù)防性的生物安全策略來防止病原通過飼料供應(yīng)鏈傳播[37]。而養(yǎng)豬場的生物安全措施應(yīng)擴(kuò)展到飼料廠，以限制病原體通過飼料供應(yīng)鏈傳播的可能性。飼料廠的成品運(yùn)輸車輛的路線應(yīng)避免與原料運(yùn)輸車輛的路線交叉，并實(shí)施嚴(yán)格的物理隔離以控制人員和車輛路線的交叉。同時應(yīng)對進(jìn)入飼料廠的車輛及轉(zhuǎn)載運(yùn)輸車輛進(jìn)行清洗消毒。而良好的生物安全管理體系是阻止病原體進(jìn)入的有效措施[31]，國內(nèi)對ASF的防控也把運(yùn)輸車輛作為重點(diǎn)的管控對象。

3 飼料中緩解ASFV的潛在解決方案

確保飼料安全的潛在解決方案主要包括生物性處理、物理性處理、化學(xué)性處理等不同類型的緩解策略，或單獨(dú)使用這些策略，或組合使用以減少飼料中潛在的ASFV污染。生物處理通常使用特定的酶或其他微生物來源的產(chǎn)品來攻擊病毒，但缺乏研究來證實(shí)這是否是飼料制造業(yè)可行的緩解策略。

飼料生產(chǎn)中的物理處理通常通過加熱實(shí)現(xiàn)，也有研究顯示，使用加熱的方式可以降低PEDV在飼料中的存活率[38]，但需注意的是病毒的熱滅活受病毒的毒株、滴度、飼料基質(zhì)特性(如pH、水分、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量)的影響。目前國內(nèi)很多養(yǎng)殖企業(yè)是通過80℃高溫制粒3 min的方式滅活病毒，但這種方式存在時間局限性，因?yàn)槠洳荒芊乐辜庸ず蟮奈廴撅L(fēng)險，此外，長時間的加熱勢必會對飼料中維生素、酶、氨基酸、益生菌等營養(yǎng)物質(zhì)造成一定的破壞[39]。另外一種是通過延長飼料的存儲時間，來降低ASFV在不同飼料原料、商品化飼料中的存活率，但也同樣面臨營養(yǎng)物質(zhì)流失的問題[40-41]。

使用化學(xué)試劑，也是目前研究比較多的一種方式，一些研究評估了在 ASFV 污染的飼料中添加中鏈脂肪酸、單甘油月桂酸酯和甲醛作為化學(xué)緩解劑，并顯示出在降低飼料ASFV含量方面的有效性[42]，但在解釋來自化學(xué)緩解劑評估研究的病毒滅活數(shù)據(jù)時應(yīng)謹(jǐn)慎，或許緩解劑可能有效滅活體外培養(yǎng)細(xì)胞中的ASFV，但將其添加到飼料成分中時可能無效[43-44]。此外，在評估緩解研究的結(jié)果時，應(yīng)考慮緩解水平和分析方法中存在的技術(shù)挑戰(zhàn)。另外，一些緩解劑可能需要以液體形式應(yīng)用于干燥的飼料成分才能產(chǎn)生效果，這可能會引起豬場負(fù)責(zé)人對促進(jìn)霉菌和細(xì)菌生長的擔(dān)憂。ZHAI等[45]通過在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中模擬ASFV對飼料的污染，驗(yàn)證出純的苯甲酸和百里香酚、丁香酚、胡椒堿、姜黃素的組合可以降低飼料中ASFV的生存能力和病毒載量，該解決方案可作為降低ASFV污染飼料風(fēng)險的預(yù)防措施，其潛在的處理病毒機(jī)制可能與破壞病毒囊膜有關(guān)[27]。但使用化學(xué)添加劑時，病毒的滅活并不意味著病毒的核酸被破壞掉，這應(yīng)被視為診斷飼料中ASFV是否具有感染性的重要因素[46]。也有研究顯示，一些植物天然提取物如芹黃素、芫花黃素、金雀異黃素、楊梅酮和楊梅苷、白藜蘆醇等在體外也表現(xiàn)一定的抗ASFV活性[47]，但缺乏動物體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)，其安全性及體內(nèi)的有效性無法保證，另外植物提取物工藝復(fù)雜，提取后的穩(wěn)定性、活性，及對活體動物的效果，均需要進(jìn)一步深入研究。

4 總結(jié)及展望

ASFV可以通過多種途徑傳播，且能在多種飼料原料以及商品化飼料中存活，飼料已經(jīng)被證明是ASFV傳播的潛在媒介，一旦ASFV進(jìn)入飼料廠，便會在飼料加工環(huán)境中迅速擴(kuò)散，而運(yùn)輸車輛、人員在ASFV傳播風(fēng)險中承擔(dān)著重要角色,在目前尚未有安全有效疫苗的情況下，豬場可以考慮采用一些物理性或者化學(xué)性的方法來降低ASFV在飼料中的傳播風(fēng)險，但需要辯證、謹(jǐn)慎的看待和應(yīng)用。

為了更好地了解豬飼料中ASFV的傳播風(fēng)險、預(yù)防控制措施，需要進(jìn)行更加深入的研究，尤其在緩解策略、凈化策略上。同時飼料企業(yè)應(yīng)積極主動地尋找方法評估、監(jiān)測以及構(gòu)建ASFV防控體系，從源頭上降低ASFV在飼料中的傳播風(fēng)險，在未來飼料廠的改造和新建中，可考慮把生物安全防控設(shè)計進(jìn)去，這也是未來維持飼料生物安全的關(guān)鍵。