李 娜，常佳偉，馬 強，馬 靚，毛彥妮，康馨勻，王 鑫，王桂琴 (寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是一種重要的人畜共患致病菌[1-2]，也是引起養(yǎng)殖場奶牛乳腺炎的病原菌之一[3]。近些年，由于抗菌藥物在動物臨床上的廣泛使用，S.aureus對抗菌藥物呈普遍耐藥和多重耐藥，乃至出現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)和食品衛(wèi)生安全造成極大威脅。為有效監(jiān)控S.aureus的感染，對S.aureus分離株進行基因分型，了解其傳播機制，最終為臨床預防和治療S.aureus的感染提供流行病學依據(jù)[4]。本研究運用PCR方法對234株S.aureus進行了19種耐藥基因的檢測，并用4種分子分型技術對寧夏地區(qū)不同奶牛場乳腺炎奶樣S.aureus分離株進行基因分型，探索該地區(qū)S.aureus菌株的流行變化趨勢及進化特點。

1 材料與方法

1.1 菌株及質控菌株234株S.aureus分離自2017—2018年寧夏銀川市、吳忠市、石嘴山市及中衛(wèi)市等地區(qū)部分奶牛養(yǎng)殖場乳腺炎奶樣；標準菌株(ATCC29213)購自中國藥品與生物制品檢定所。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及主要儀器科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自CHRO Magar公司；MHB肉湯購自北京陸橋技術有限公司；2×Taq PCR Master Mix購自諾唯贊公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化有限公司，細菌基因組的提取按照試劑盒說明書進行；PCR引物及擴增產物測序由上海生工生物工程有限公司完成。PCR擴增儀購自美國Applied Biosystems公司;高速離心機購自德國Eeppendorf公司；電泳及成像系統(tǒng)與脈沖場凝膠電流儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 多位點序列分型(MLST)參考文獻[5]對金黃色葡萄球菌7個看家基因(arcc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi、yqil)引物進行合成和擴增，引物序列及片段大小見表1。PCR反應選用50 μL體系，以55℃為最佳退火溫度進行擴增。擴增產物進行電泳、測序和序列分析，并將處理好的序列提交至相關數(shù)據(jù)庫(http://saureus.mlst.net/和https://pubmlst.org/)，最終確定其ST型。

1.4spa分型參考文獻[6]與spa分型網絡數(shù)據(jù)庫(http://spaserver2.ridom.de/frequencies.shtml),采用PCR和網絡數(shù)據(jù)庫對比分析的方法對S.aureus進行spa分型，引物序列及片段大小見表1。PCR反應選用50 μL體系，以60℃為最佳退火溫度進行擴增。將擴增產物進行電泳、測序并提交至數(shù)據(jù)庫(http://spa.ridom.de/mLst.shtmL和http://seqtools.com)進行分析，獲得spa分型。

1.5 RAPD分型參考文獻[7]合成引物對S.aureus進行RAPD分型，引物序列及片段大小見表1。PCR反應選用50 μL體系，以28℃為退火溫度進行擴增，將擴增產物電泳，經凝膠成像系統(tǒng)拍照獲取圖像，通過Quantity One和NTSYS.2.10e軟件分析圖像并構建樹狀圖。

1.6agr分型參考文獻[8]設計合成引物，采用多重PCR方法對234株S.aureus進行agr分型，引物序列及片段大小見表1。PCR反應選用50 μL體系，以55℃為退火溫度進行擴增。將擴增產物進行電泳及分析，得出菌株的agr分型。

表1 不同分型PCR引物信息

1.7 耐藥基因檢測根據(jù)文獻[9-17]設計合成引物，分別擴增β-內酰胺類耐藥基因blaZ；大環(huán)內酯類耐藥基因ermA、ermB、ermC；氨基糖苷類耐藥基因aacA-aphD；酰胺醇類耐藥基因fexA； 氟喹諾酮類耐藥基因gyrA、grlA、norA；四環(huán)素類耐藥基因tet(L)、tet(k)、tet(M)、tet(O)；林可酰胺類耐藥基因Lin(A)；磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3；惡唑烷酮類耐藥基因optrA、cfr等9類共19種耐藥基因。PCR反應選用20 μL體系，引物序列、片段大小及退火溫度見表2。將擴增產物進行電泳及測序分析。

表2 PCR擴增引物序列和反應運行參數(shù)

續(xù)表2

1.8 統(tǒng)計學分析用SPSS統(tǒng)計軟件對不同分型間攜帶耐藥基因譜間的差異進行卡方檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MLST分型對234株S.aureus進行MLST分型，7個管家基因PCR擴增片段與預期結果一致(圖1)。234株菌株每個位點的等位基因編號和MLST型別見表3，所有菌株被分為11種ST型，以ST50為主，占40.60%，其次為ST4053(23.93%)、ST97(18.80%)。

M.DL2000 DNA Marker；1.gmk；2.tpi；3.aroe；4.yqil；5.glpf；6.pta；7.arcc；N.空白對照圖1 S.aureus 管家基因PCR結果

表3 S.aureus的 MLST 分型結果

2.2spa分型234株S.aureusspa分型結果見表4。共包含20種基因型，主要以t224型為主，有155株，占66.24%；其次為t518，占6.84%。部分菌株電泳條帶見圖2。

M.DL2000 DNA Marker；1～7.部分檢測樣品；N.空白對照圖2 部分S.aureus spa基因擴增產物電泳圖

表4 S.aureus的 spa 分型結果

2.3agr分型234株S.aureus共包含4種亞型，主要以Ⅰ型為主，有143株菌，占61.11%，其次為agrⅡ型和agrⅣ型，分別有42株菌(17.95%)、31株菌(13.24%)，檢出最少的是agrⅢ型有18株菌(7.69%)。

2.4 RAPD分型通過RAPD分型技術對234株S.aureus進行分型，電泳檢測結果顯示，234株S.aureus中有211株擴增后產生清晰的指紋圖譜，擴增條帶數(shù)在1～5之間，條帶相對分子質量在50～2 000 bp之間，清楚地反映菌株間的基因多態(tài)性特征(部分菌株電泳圖見圖3)。從表5中可以看出，牧場1主要以Ⅳ型為主，其次為Ⅲ型，其他幾個牧場各個型均有分布。

M.DL2000 DNA Marker；1～13.部分檢測樣品圖3 部分S.aureus RAPD分型電泳圖

表5 各牧場金黃色葡萄球菌的RAPD分型分布 株

通過NTsys2.1軟件對指紋圖譜進行聚類分析，結果見圖4，在70%的相似水平上，211株S.aureus分為6個主要聚類群，其中Ⅳ型為本地區(qū)主要流行的優(yōu)勢菌群，有68株菌，占29.06%，其次為Ⅰ、Ⅲ型，分別有30(12.82%)，44(18.80%)株菌。

圖4 金黃色葡萄球菌部分RAPD分型系統(tǒng)進化樹

2.5 耐藥基因檢測、耐藥基因譜及分子特征對234株S.aureus進行了19種耐藥基因的檢測，共檢出13種耐藥基因，其中gyrA、norA、grlA3種基因的檢出率最高，分別為97.85%，97.85%，95.70%；其次為blaZ基因，檢出率為 64.52%；其余9種耐藥基因的檢出率均低于10%，沒有檢出tet(O)、optrA、cfr、Sul1、Sul2 和Sul3 耐藥基因(圖5)。

圖5 金黃色葡萄球菌中19種耐藥基因的檢出率

所有菌株均不同程度地攜帶多種耐藥基因，共形成40種耐藥基因譜，攜帶3種及以上耐藥基因的菌株占97.86%(229/234)，攜帶4種耐藥基因的菌株最多，占47.86%(112/234)，其中98株耐藥基因譜為grlA-norA-gyrA-blaZ的菌株，有82株spa-t224，84株agr-Ⅰ，63株ST50型與25株RAPD-Ⅳ型；其次是攜帶3種耐藥基因，占34.62%(81/234)，其中47株耐藥基因譜為grlA-norA-gyrA的菌株，有32株spa-t224，26株agr-Ⅰ，23株ST4053型與20株RAPD-Ⅳ型(表6)；攜帶5種耐藥基因、7種耐藥基因和8種耐藥基因的菌株分別占10.26%(24/234)，2.99%(7/234)，1.70%(4/234)；而攜帶6種耐藥基因、9種耐藥基因和11種耐藥基因的菌株僅有1株，分別占0.43%(圖6)。

圖6 金黃色葡萄球菌中多重耐藥基因檢出結果

2.6 不同分型間耐藥基因譜攜帶率的比較spa分型中，t224型與t359、t521、t519菌株耐藥基因譜攜帶率間差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為19.71，21.78，26.47，P<0.01)；agr分型中，Ⅰ與Ⅲ、Ⅳ型菌株耐藥基因譜攜帶率間差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為9.53，23.15，P<0.01)；MLST分型中，ST50與ST97、ST4053型菌株耐藥基因譜攜帶率間差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為25.00，38.48，P<0.01)。

3 討論

在全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，S.aureus是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌之一。隨著其耐藥性和致病能力的發(fā)展，尤其伴隨著MRSA流行株的出現(xiàn)，S.aureus對動物和人類的健康已造成嚴重威脅。更由于不同時期、不同地區(qū)流行的S.aureus菌株基因型不同，使S.aureus臨床抗感染治療面臨極大挑戰(zhàn)[18]。為使臨床治療和防控更具針對性，對該地區(qū)S.aureus菌株的變化特點和流行趨勢的監(jiān)測必不可少。

MLST分型技術是一種基于細菌管家基因序列測定的高分辨率分子流行病學研究手段[19]，已被用于鑒定和研究S.aureus克隆體在人類感染和牛乳腺炎中的分布[20]，然而，有關牛源分離株的MLST數(shù)據(jù)仍然很少。不同國家與地區(qū)ST型的流行類型不同，且區(qū)域差異較大[19]，歐美地區(qū)以MRSA-ST398為主要流行型別，在多種不同的宿主中(包括人、豬、馬和小牛等)都有見報道[21-23]，國內動物源MRSA則以ST9為主[24-26]。本研究對234株S.aureus進行了MLST分型，ST50、ST4053和ST97為優(yōu)勢型別，而國內不同地區(qū)MLST流行型也不盡相同；北京、內蒙、新疆、山東、山西、浙江等地均有一定數(shù)量的牛源S.aureus被分離，優(yōu)勢MLST分型主要集中于ST97和ST398[27]，在本研究中ST97型(44，18.80%)也有被檢出，表明ST97已經在我國牛源S.aureus中流行。

有研究表明spa與S.aureus分型的“金標準”脈沖場凝膠電泳(PFGE)的分析結果具有相同的高效性[28]。此外，CELIO等[29]報道，spaX區(qū)多態(tài)性與生物體對不同條件的適應有關，如不同的宿主群體、天氣和地理多樣性。本研究結果顯示，234株S.aureus被分為20種spa型，其中最常見的spa型是t224型(66.24%)。而在河南、江蘇、廣州地區(qū)流行的spa型分別是t15075、t030、t037[30-32]。t224型作為主要優(yōu)勢菌株在國內其他地區(qū)還未見報道，說明我國不同地區(qū)S.aureus的spa分型優(yōu)勢菌株不具有唯一性。此外，ASADOLLAHI等[33]研究發(fā)現(xiàn)t030是亞洲以及中國主要流行的spa型；t032、t008、t037和t202分別是歐洲、美國、非洲和澳大利亞的spa流行型。研究成果表明，不同來源及不同地理位置的S.aureus對其環(huán)境的選擇性適應導致spa分型具有多樣性。

RAPD分型是一種以DNA基因組中較短序列重復出現(xiàn)的頻率為理論依據(jù)，建立在PCR技術基礎上的DNA分析技術[34]。因其操作簡便，耗時短，引物通用等特點被廣泛用于微生物的分子分型和鑒定領域的研究。本研究中，寧夏地區(qū)S.aureus最主要流行的優(yōu)勢菌群為RAPDⅣ型(29.06%)，其次為Ⅰ、Ⅲ型，這與WANG等[35]的研究結果相似。而在其他報道中[4]Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與Ⅴ型分別是貴州、上海、甘肅與內蒙古地區(qū)主要流行的優(yōu)勢菌群，表明牛源S.aureus的感染隨著地區(qū)、氣候及養(yǎng)殖水平的不同而有較大變化。各牧場菌株基因型分布有明顯差異，牧場7內只發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型3種RAPD型，且無明顯占優(yōu)勢的基因型，可能與樣本數(shù)量較少有關，但在一定程度上也反映出牧場7中菌株與其他牧場流行傳播較少，所以基因型分布較其他牧場簡單。其他牧場各基因型分布廣泛，可能是細菌在牧場間流行傳播較頻繁，菌株基因產生顯著變異，但更多應該考慮的原因是養(yǎng)殖環(huán)境和管理水平較差導致地區(qū)間流行[35]。

在S.aureus中，agr系統(tǒng)負責調控S.aureus毒力因子的表達，利用agr基因位點序列的多態(tài)性，可將S.aureusagr分為agrⅠ～Ⅳ型。較spa與RAPD分型，國內agr分子分型在牛乳源S.aureus上的研究報道較少。本研究agr分型結果顯示，寧夏地區(qū)牛源S.aureus主要為agrⅠ型(61.11%)，與張行等[36]對甘肅、山西、黑龍江和江蘇地區(qū)S.aureus的分型結果相似，而與陳程[37]在寧夏地區(qū)研究結果不同，推測可能與采樣時期不同有關。目前已有研究報道，在不同地區(qū)優(yōu)勢克隆并不唯一，同一地區(qū)不同時期的優(yōu)勢克隆也會發(fā)生變化[19]，說明對不同時期S.aureus的流行病學監(jiān)測是非常重要的。此外，據(jù)報道，S.aureusagrⅣ型的流行率較低，檢出率通常低于3.70%[38]，本研究中，agrⅣ型的檢出率為13.24%，這可能與S.aureus的遺傳背景有一定關系，基因背景差異導致不同地域的agr基因型進化出現(xiàn)多樣性[39]，但這種不同地域分布特征差異及相關機制有待進一步研究。

S.aureus日趨嚴重的耐藥現(xiàn)象與耐藥基因的存在息息相關。本試驗結果顯示，受試菌株中氟喹諾酮類耐藥基因檢出率最高，gyrA、norA和grlA基因的攜帶率分別為97.85%，97.85%，95.70%，與陳程[37]的報道結果相近。值得注意的是，本實驗室前期研究表明[40]，本地區(qū)S.aureus對氟喹諾酮類抗菌藥物環(huán)丙沙星的耐藥率只有4.70%，這一現(xiàn)象可能與氟喹諾酮類耐藥基因的轉錄與表達水平有關，有待進一步的研究。β-內酰胺類耐藥基因blaZ的檢出率為64.52%，實驗室前期試驗表明S.aureus對β-內酰胺類抗生素氨芐西林的耐藥率為85.90%，兩者之間存在較好的相關性。與此同時，受試菌株對β-內酰胺類藥物頭孢噻呋的耐藥率相對較低，只有10.26%，推測可能與β-內酰胺類抗生素不同種類藥物在臨床上的用法和用量有關。此外林可酰胺類耐藥基因、氨基糖苷類耐藥基因、大環(huán)內酯類耐藥基因、四環(huán)素類耐藥基因攜帶率與耐藥表型基本相符。

此外，本研究并未檢出Sul1、Sul2和Sul3 磺胺類耐藥基因，但實驗室前期研究卻發(fā)現(xiàn)，受試菌株對磺胺類抗菌藥物磺胺異惡唑的耐藥率達到了63.20%，表明S.aureus耐磺胺類藥物的耐藥機制不僅與耐藥基因的存在及表達相關，也與生物膜等其他耐藥因素有關，這與杜偉偉[17]、陳程[37]的報道相符。結果顯示，寧夏地區(qū)S.aureus耐藥基因攜帶情況呈多樣性，氟喹諾酮類和β-內酰胺類耐藥基因攜帶率較高，須對S.aureus耐藥基因型進行跟蹤調查，明確寧夏地區(qū)S.aureus菌株的耐藥情況。

本研究對寧夏不同地區(qū)的牛乳源S.aureus進行了4種不同分子分型研究。ST50-t224-RAPDⅣ-agrⅠ為寧夏地區(qū)主要流行菌株，屬于檢測和防控的重點對象，且S.aureus菌株分型與攜帶耐藥基因有關。不同地區(qū)各牧場菌株基因型分布差異較大，說明S.aureus的流行趨勢會隨著地理位置、養(yǎng)殖管理水平及采樣時期的不同而產生變化。實時監(jiān)控S.aureus分子流行病學特征，有利于臨床抗感染治療時抗生素的合理選擇，降低其在本地區(qū)的流行傳播，為奶牛乳房炎的防控與治療提供理論依據(jù)。同時S.aureus的各種分子分型方法各有特點，在進行菌株遺傳相關性分析時，應根據(jù)實際工作需求選擇不同分子分型方法對菌株進行綜合分析，保證分型結果的高分辨性與可重復性。