董 林，王艷萍，唐 娜，徐倩倩，苗立中，王金良，沈志強(qiáng)* (.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是已知最小的單股DNA病毒，病毒結(jié)構(gòu)為閉合環(huán)狀，無囊膜，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰歇綜合征(post weaning multi-systemic syndrone，PMWS)的主要病原[1]。PCV2主要浸染免疫系統(tǒng)，損傷免疫細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的發(fā)生，感染仔豬的淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體、胸腺等免疫器官呈現(xiàn)淋巴細(xì)胞的缺失、減少和單核巨噬細(xì)胞的浸潤為主要特征的病理變化[2]?，F(xiàn)階段對相關(guān)因子分泌的相互影響和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究鮮見報(bào)道，特別是調(diào)控細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞間信號通路還未有明確報(bào)道[3]。

核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一類參與促進(jìn)多種基因轉(zhuǎn)錄的多向性核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel蛋白家族，主要包括P50、P52、c-Rel、RelA(P65)、RelB共5個(gè)家族成員，廣泛存在于真核細(xì)胞中，是體內(nèi)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要通路[4]。NF-κB含有300個(gè)氨基酸組成的Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain，RHD)，RHD通過其DNA結(jié)合區(qū)、二聚體化區(qū)域及核定位序列與含有κB序列的DNA結(jié)合，與同源或異源亞單位形成二聚體或者與IκB抑制蛋白相互作用調(diào)節(jié)核定位[5]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，可誘導(dǎo)IκB磷酸化啟動(dòng)降解途徑，使得NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[6-7]。

本試驗(yàn)選取PCV2感染的體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞，研究PCV2作用時(shí)間與NF-κB激活途徑和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)之間關(guān)系，探索NF-κB的激活機(jī)制及其對細(xì)胞因子的影響，以期為PCV2感染防制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒PCV2 LVDU株(含病毒105.5TCID50/mL)，由山東綠都生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28日齡PCV2抗原、抗體雙陰性健康易感仔豬10頭，由山東濱州禾川林豐畜牧科技有限公司養(yǎng)殖場提供。

1.3 主要試劑與儀器RRPMI-1640培養(yǎng)基(R8758-500，Gibco公司)；小牛血清(20200145，天津康源生物)；核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自北京天根生物；NF-κB EMSA試劑盒，化學(xué)發(fā)光液為美國Millpore公司產(chǎn)品；兔抗NF-κB/P65單克隆抗體、鼠抗豬p-IκBα單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；TRITC-羊抗兔酶標(biāo)抗體購自中杉金橋有限公司。恒溫恒濕CO2培養(yǎng)箱(Heracell 150i，Thermo公司)；高速冷凍離心機(jī)(ST16R，Thermo公司)；蛋白電泳儀為(Mini-Protean Tetra，BioRad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Fusion Solo，法國Vilber公司)；激光共聚焦顯微鏡(A1si+A1Rsi+，日本Nikon公司)。

1.4 體外脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及PCV2接毒10頭經(jīng)檢測PCV2抗原、抗體雙陰性的28日齡仔豬，無菌采集、分離脾臟細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整單層細(xì)胞濃度到6×106個(gè)/mL，在容積為250 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入25 mL 制備的細(xì)胞懸液，分為對照組和PCV2感染組。感染組每毫升細(xì)胞懸液加PCV2病毒懸液200 μL；對照組加等量培養(yǎng)液。放入CO2培養(yǎng)箱中于37℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)0，6，12，24，48 h收取懸浮的淋巴細(xì)胞和上清液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取淋巴細(xì)胞2 mL用于激光共聚焦檢測，其余液氮速凍后置-70℃ 保存?zhèn)溆?。?xì)胞上清液用ELISA試劑盒檢測分泌的細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β1的含量。

1.5 激光共聚焦檢測NF-κB核移位取不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS(pH7.2)洗滌3次后重懸，取100 μL加入經(jīng)對聚賴氨酸處理凹玻片上，室溫靜置15 min，浸入4%的多聚甲醛固定10 min，用0.5%TritonX-10+PBS室溫通透；再用PBS洗5次，5%小牛血清封閉30 min，加入NF-κB/P65一抗37℃孵育45 min；洗滌后加入熒光二抗37℃孵育30 min，洗滌后加入核染液Hoechst，室溫孵育5 min，洗滌5次后加入淬火液，于激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果(波長560 nm)。

1.6 Western blot檢測NF-κB/P65、p-IκB蛋白分別提取體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白，操作按Pierce核蛋白提取試劑盒操作說明書進(jìn)行。提取蛋白用BCA法測定蛋白濃度，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 NF-κB與核蛋白中DNA結(jié)合活性檢測依據(jù)EMSA試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取核蛋白進(jìn)行非變性SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移NC膜上，紫外燈下交聯(lián)10 min，化學(xué)發(fā)光法檢測生物素標(biāo)記的DNA，LNS-4000成像系統(tǒng)進(jìn)行測量和分析。

1.8 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子分泌蛋白含量取不同時(shí)間細(xì)胞上清液，進(jìn)行IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β1含量檢測。具體操作按照對應(yīng)ELSIA試劑盒說明書進(jìn)行。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品檢測后于450 nm酶標(biāo)儀讀取D值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出各D值對應(yīng)的樣品蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 PCV2對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞NF-κB/P65蛋白核移位的影響激光共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果(圖1)顯示，PCV2感染后6 h可觀測到明顯的核內(nèi)NF-κB/P65蛋白存在，淋巴細(xì)胞中隨著PCV2感染時(shí)間的增加，NF-κB/P65入核易位呈現(xiàn)不斷增強(qiáng)的趨勢。對照組僅在24 h才能觀測到部分淋巴細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)少量NF-κB/P65蛋白存在。

A.PCV2接種后0 h； B.PCV2接種后6 h；C.PCV2接種后12 h；D.PCV2接種后24 h；E.PCV2接種后48 h。細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，胞質(zhì)NF-κB/P65蛋白染色呈紅色，易位核內(nèi)染色合成呈粉紅色圖1 PCV2感染對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞NF-κB核易位影響

Western blot檢測結(jié)果如圖2，隨著PCV2作用體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞時(shí)間的延長，細(xì)胞核中NF-κB/P65蛋白含量呈現(xiàn)逐漸增多， PCV2作用6 h試驗(yàn)組細(xì)胞核中NF-κB/P65含量顯著高于對照組(P<0.05)，隨著作用時(shí)間增加，試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/P65均呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，在隨后觀測時(shí)間段內(nèi)，試驗(yàn)組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/P65含量均顯著高于對照組，其中24和48 h極顯著高于對照組(P<0.01)。說明PCV2感染，可導(dǎo)致體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中NF-κB/P65發(fā)生核易位，并呈現(xiàn)明顯的“時(shí)間-效應(yīng)”累增關(guān)系。

A.Western blot檢測p-IκBα含量結(jié)果；B.p-IκBα蛋白相對表達(dá)量。**.與對照組差異極顯著(P<0.01);*.與對照組差異顯著(P<0.05)。下同圖2 PCV2感染對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/P65蛋白表達(dá)影響(n=10)

2.2 PCV2對細(xì)胞核中NF-κB與DNA結(jié)合率的影響PCV2對體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞核蛋白NF-κB與DNA結(jié)合率的EMSA法檢測結(jié)果見圖3。體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞在PCV2感染條件下，隨著作用時(shí)間的增加，NF-κB與DNA結(jié)合率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，12 h 開始PCV2攻毒組結(jié)合率顯著高于對照組(P<0.05)，其中24和48 h極顯著高于對照組(P<0.01)，說明PCV2能促進(jìn)易位的NF-κB與DNA結(jié)合，且呈現(xiàn)“時(shí)間累積效應(yīng)”。

A.NF-κB與DNA結(jié)合EMSA檢測結(jié)果(D.NF-κB與DNA結(jié)合帶;F.無結(jié)合帶)；B.DNA結(jié)合活性結(jié)果圖3 PCV2感染對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞核中NF-κB與DNA結(jié)合率的影響(n=10)

2.3 PCV2對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞質(zhì)中p-IκBα蛋白含量的影響Western blot對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞中p-IκBα含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。隨著PCV2感染作用時(shí)間的增加，淋巴細(xì)胞質(zhì)中p-IκBα蛋白呈現(xiàn)穩(wěn)定增加，從培養(yǎng)6 h開始，淋巴細(xì)胞質(zhì)中p-IκBα含量明顯高于對照組，24 h開始極顯著高于對照組，顯示PCV2具有明顯的促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)κB磷酸化的作用。

A.Western blot檢測p-IκBα含量結(jié)果；B.p-IκBα蛋白相對表達(dá)量圖4 PCV2感染對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞質(zhì)中p-IκBα蛋白含量的影響(n=10)

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌細(xì)胞因子含量檢測

2.4.1細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌型IL-1β和IL-6含量檢測 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6檢測結(jié)果分別見圖5～6。相對于對照組，PCV2感染組IL-1β在24和48 h含量均高有所升高，但與對照組差異不顯著(P>0.05)。相對于對照組，PCV2感染組IL-6在24 h時(shí)增加明顯，48 h感染組 IL-6含量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量檢測結(jié)果

圖6 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6含量檢測結(jié)果

2.4.2細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌型IL-17和TNF-α含量檢測 上清中IL-17和TNF-α含量結(jié)果見圖7～8。PCV2攻毒后6 h，攻毒組細(xì)胞上清中IL-17含量明顯升高，12和24 h極顯著促進(jìn)IL-17分泌(P<0.01)，48 h時(shí)還明顯高于對照組IL-17含量(P<0.05)，結(jié)果顯示PCV2攻毒隨著時(shí)間延長可明顯升高體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞分泌IL-17水平。PCV2攻毒后6 h，攻毒組TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，12 h降至對照組水平，隨后急劇增加，24 h達(dá)到峰值，48 h有所降低，但還極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖7 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17含量檢測結(jié)果

圖8 細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量檢測結(jié)果

2.4.3細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌型IL-10和TGF-β1含量檢測 IL-10含量檢測結(jié)果見圖9，PCV2攻毒后，體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞從6 h開始分泌IL-10水平明顯升高，且在隨后的12，24和48 h均高于對照組水平，其中12 h達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P<0.05)。TGF-β1含量變化見圖10，其變化趨勢呈現(xiàn)先降低后升高的特征，6 h明顯低于對照組，兩者差異顯著(P<0.05)，12 h還明顯低于對照組，24 h開始升高，48 h急劇增加，極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖9 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量檢測結(jié)果

圖10 細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1含量檢測結(jié)果

3 討論

NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控基元，在炎性細(xì)胞因子激活與表達(dá)過程中起著重要的調(diào)控作用，并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)最終進(jìn)程。研究證實(shí)NF-κB信號活化與多種炎性細(xì)胞因子(IL-10、IL-6、TGF-β1和TNF-α)之間存在密切關(guān)聯(lián)[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PCV2感染時(shí)間延長，NF-κB/P65的核易位強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，核內(nèi)NF-κB/P65蛋白含量不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯“時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系。隨著核內(nèi)NF-κB/P65蛋白含量的增加，NF-κB與DNA的結(jié)合效率呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)。本試驗(yàn)證實(shí)，PCV2感染可導(dǎo)致體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中NF-κB信號激活，表現(xiàn)明顯的核易位轉(zhuǎn)移和DNA結(jié)合活性增強(qiáng)，為調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)提供條件，這一結(jié)果與呂春子等[11]的研究一致。WEI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號途徑可以被PCV2有效激活，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白含量和NF-κB與DNA結(jié)合活性增加，有利于病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。PCV2能有效激活淋巴細(xì)胞中的NF-κB信號，易位至細(xì)胞核內(nèi)與DNA調(diào)控元件結(jié)合，可有效調(diào)控細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)，該途徑可能是PCV2導(dǎo)致免疫抑制發(fā)生的重要途徑[13]。

NF-κB激活通路存在“經(jīng)典途徑”和“旁路途徑”2條不同途徑[14]?！敖?jīng)典途徑”通過促發(fā)胞質(zhì)中IκB的磷酸化降解導(dǎo)致信號激活，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，該途徑主要參與機(jī)體調(diào)控炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在PCV2作用下，體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中p-IκB蛋白從6 h開始顯著高于對照組(P<0.05)，至24 h 極顯著高于對照組(P<0.01)，這種現(xiàn)象基本與NF-κB/P65蛋白入核和DNA結(jié)合活性同步，進(jìn)一步證實(shí)PCV2是通過經(jīng)典途徑實(shí)現(xiàn)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，炎性因子IL-1β和IL-6在PCV2感染后含量變化不明顯，僅IL-6在48 h顯著高于對照組(P<0.05)，這與陳耿等[15]的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α和IL-17在PCV2作用 6 h開始明顯升高，在24 h達(dá)到峰值，其中TNF-α表現(xiàn)出在12 h明顯降低，這一結(jié)果與相關(guān)學(xué)者研究不一致，這可能與TNF-α和IL-17同時(shí)具有正調(diào)節(jié)免疫活性和產(chǎn)生炎癥損傷的特點(diǎn)有關(guān)，早期的含量增加主要表現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，后期含量升高可能導(dǎo)致免疫損傷[16]。本試驗(yàn)中PCV2感染12 h出現(xiàn)IL-10明顯的含量增加，提示PCV2可導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制，這與相關(guān)研究結(jié)果一致。在PCV2感染6，12 h時(shí)TGF-β1出現(xiàn)明顯降低，這可能是感染PCV2后機(jī)體免疫反應(yīng)增強(qiáng)，隨后開始升高，48 h顯著高于對照組，可能與機(jī)體免疫抑制發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)。細(xì)胞因子含量檢測進(jìn)一步證實(shí)PCV2可以激活NF-κB信號通路，并導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)變化。

綜上，本研究從NF-κB的核易位、核蛋白NF-κB/P65含量變化，NF-κB與核內(nèi)DNA結(jié)合效率以及炎性細(xì)胞因子分泌表達(dá)等4個(gè)方面評價(jià)了NF-κB細(xì)胞信號通路激活的主要特征，定量檢測PCV2對體外培養(yǎng)仔豬淋巴細(xì)胞NF-κB信號通路激活及其對炎性細(xì)胞因子表達(dá)活性的影響，為PCV2感染、致病機(jī)理和免疫應(yīng)答研究奠定了一定基礎(chǔ)。