賈晉茹，徐萌，韓軍，裴家偉，田益玲，2，3，何俊萍*

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北?。ㄐ吓_）核桃產業(yè)技術研究院，河北 邢臺 054000；3.河北省核桃工程技術中心，河北 邢臺 054000）

核桃又名胡桃，作為我國的一種優(yōu)良經濟作物，在2017年其產量就高達385萬噸，產值達933.4億元[1-2]。核桃除可以鮮食外，主要是被用來榨油，核桃油以其豐富的不飽和脂肪酸被世人所推崇[3-4]。就在核桃油暢銷的同時，也面臨著核桃粕的處理與應用的問題。核桃粕中的蛋白質含量豐富，占其干重的43%以上，含有的18種氨基酸中有8種必需氨基酸與聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）推薦的人體氨基酸模式相近，被認為是優(yōu)質蛋白[5-6]。但目前核桃粕整體利用率低下，基本被用作動物飼料或直接丟棄，不僅造成環(huán)境污染，還導致大量蛋白資源的浪費[7-9]。所以對核桃蛋白進行發(fā)酵降解，進一步提高核桃粕的綜合利用價值，對核桃資源的開發(fā)與利用具有重要意義。蛋白酶是原料降解過程中的重要酶類，決定著生成氨基酸、短肽、多肽的多寡，關系著原料的充分利用與否[10]。而米曲霉是目前微生物發(fā)酵產蛋白酶最重要的菌株，其生長迅速，使用方便，對營養(yǎng)環(huán)境要求低，是表達外源蛋白的理想宿主[11]。米曲霉的基因組中含有135個胞外蛋白酶基因，其胞外蛋白酶系非常復雜，主要是通過頂端分泌的方式分泌到胞外，并且在發(fā)酵過程中不產生毒素，是分解各類蛋白的最佳選擇[12]。其產生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，由于在發(fā)酵期間不同蛋白酶之間交替發(fā)生作用，往往能夠賦予產品獨特的風味[13]。蛋白酶的酶活性高低是米曲霉菌種的衡量指標，蛋白酶活性的高低決定著蛋白質的利用率，高的酶活力不僅可以更好地分解原料，提高原料利用率，而且還可以減少釀造工業(yè)的污染，對于實際生產具有十分重要的作用[14]。本文采用滬釀3.042米曲霉為菌種對核桃粕進行發(fā)酵，以蛋白酶活力為評價指標，通過單因素和正交試驗確定米曲霉發(fā)酵核桃粕產蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，為核桃粕蛋白資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕：河北綠嶺有限公司生產基地；滬釀3.042米曲霉：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；福林試劑、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑、石油醚、硫酸銅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、干酪素、酪氨酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XL-100馬弗爐：鶴壁億欣儀表有限公司；UV-1700PC紫外可見分光光度計：上海美析儀器分析公司；WS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海樹立儀器儀表公司；MB35水分測定儀：瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米曲霉發(fā)酵核桃粕工藝流程

以冷榨核桃粕為原料，進行粉碎和過篩，并將篩下物做浸潤處理。潤料完成后，將核桃粕放入鍋中蒸煮1 h后燜鍋冷卻。待物料溫度降到32℃后，接入一定量的米曲霉菌種，混合均勻后平鋪到托盤中，料厚1.0 cm～1.5 cm，并在物料上蓋6層濕紗布，每隔2 h向濕布上噴灑無菌水保持紗布的濕潤狀態(tài)，以保證米曲霉生長所需的濕度。最終將物料放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。由于菌種在生長繁殖的過程中會產熱，在培養(yǎng)的過程中，物料的溫度往往會高于培養(yǎng)箱的溫度，所以需要在物料中插入溫度計，以實時監(jiān)測物料溫度。

1.3.2 核桃粕基本成分的測定

用紅外線快速水分測定儀來測定水分含量；灰分參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》進行測定；脂肪含量參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》進行測定；蛋白含量參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》進行測定；根據(jù)減差法計算出碳水化合物含量，即總碳水化合物含量等于100%減去樣品的水分含量、脂肪含量、灰分含量以及蛋白質含量的總和。

1.3.3 核桃粕中蛋白酶活力的測定

1.3.3.1 蛋白酶標準曲線的繪制

以酪氨酸為標準品，根據(jù)酪氨酸不同濃度所對應的吸光度值繪制標準曲線，如圖1所示。所得標準曲線的回歸方程為y=0.0100x-0.003 4，R2=0.99，線性關系良好。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

1.3.3.2 蛋白酶活力的計算

根據(jù)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的福林法并稍作修改，進行蛋白酶活性的測定與計算。

式中：X為樣品蛋白酶活力，U/g；A為樣品在波長為660nm時測得的吸光度值；N為樣品稀釋倍數(shù)（稀釋10倍）；k為標曲的斜率。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 浸潤水量的選擇

稱取核桃粕100 g，分別用物料質量分數(shù)的40%、50%、60%的水量去潤料30 min，浸潤完成后將核桃粕在2 200 W的功率下蒸煮1 h，測定熟料的水分含量。

1.3.4.2 發(fā)酵溫度對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，接入0.025%的米曲霉菌種，分別于28、31、34、37℃的溫度下恒溫發(fā)酵48 h后，測定蛋白酶活力，每個樣品做3次平行。

1.3.4.3 發(fā)酵時間對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，接入0.025%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫發(fā)酵 24、34、44、48、52 h后，測定蛋白酶活力，每個樣品做3次平行。

1.3.4.4 米曲霉添加量對核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，分別接入0.005%、0.010%、0.015%、0.025%、0.035%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫發(fā)酵48 h后，測定蛋白酶活力，每個樣品做3次平行。

1.3.4.5 通風量對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取2份100 g的核桃粕，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后接入0.015%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫培養(yǎng)，其中一份核桃粕在培養(yǎng)過程中通風處理，48 h后測定其蛋白酶活力。

1.3.5 正交試驗優(yōu)選最佳產酶條件

在單因素試驗的基礎上，分析各因素的適宜水平，選擇發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時間3個因素進行正交試驗，以進一步優(yōu)化米曲霉在核桃粕中發(fā)酵的最佳產酶條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Level of orthogonal test

1.3.6 米曲霉在核桃粕與豆粕中蛋白酶活力的比較

稱取核桃粕與豆粕各100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，按照正交試驗得出的最佳產酶條件，對兩種物料各自進行發(fā)酵處理，測定其蛋白酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS 22.0、Excel 2010軟件；做圖用Origin8.6。試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 核桃粕基本成分分析

利用1.3.2方法對核桃粕的主要成分進行測定，測定結果見表2。

表2 核桃粕基本成分分析Table 2 Analysis of basic components of walnut meal

由表2可知，核桃粕中的蛋白含量高達51.36%，如果將這部分蛋白合理高效地利用起來，對提高核桃附加價值，促進企業(yè)經濟效益將具有重大意義。核桃粕脂肪25.94%，碳水化合物11.51%，不僅滿足了米曲霉所需的氮源和碳源，而且部分脂肪的氧化為最終產品提供了部分風味物質。

2.2 浸潤水量的選擇

浸潤水量與熟料水分對比見表3。

表3 浸潤水量與熟料水分對比Table 3 Comparison of infiltration water and clinker water

如表3所示，對核桃粕進行不同浸潤水量的處理并蒸煮后，所對應的熟料中水分含量相差不大。冷榨核桃蛋白具有良好的吸水性[15]，其通過與水的相互作用而具有結合水的能力，蛋白質的帶電基團、親水基團和非極性基團都可以與水分子緊密結合[16]。在蒸料的過程中，由于高溫及水蒸氣的作用，使得核桃蛋白發(fā)生變性并形成凝膠，吸水性增強[17]。同時也會使經過不同浸潤水量處理的物料在蒸煮后，達到基本相近的水分含量。水分對米曲霉產酶的影響主要體現(xiàn)在對米曲霉營養(yǎng)傳輸途徑的保證上，熟料水分保持在40%～50%最為恰當。物料水量過高則會導致其氧氣含量降低，過低則營養(yǎng)傳遞的界面喪失，這樣都會使米曲霉的蛋白分泌受到影響[18]。所以本試驗采取60%的浸水量進行操作。同時由于滬釀3.024的遺傳特性決定了其分泌中性和堿性蛋白酶的能力遠比分泌酸性蛋白酶能力強，因此在培養(yǎng)的過程中還是以中性pH值為好（pH=7左右）[19]。因此本試驗采用中性自然的無菌水進行浸潤。

2.3 發(fā)酵溫度對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

發(fā)酵溫度對米曲霉酶活力的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對米曲霉酶活力的影響Fig.2 Effect of ferment temperature on enzyme activity of soy sauce koji

在不同發(fā)酵溫度下，米曲霉在核桃粕中的所產生的蛋白酶活力不同。米曲霉屬于中溫菌，在30℃左右的環(huán)境下菌落生長最好，過高或過低的溫度均會對其產生抑制作用[20]。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米曲霉分泌酶的能力不斷增強，使核桃粕中的蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為31℃時，核桃粕中的蛋白酶活力（1 254.67 U/g）達到了峰值，說明此時的溫度最適合米曲霉在核桃粕中分泌蛋白酶。當發(fā)酵溫度超過31℃后，米曲霉的活動受到了溫度的限制，生成的蛋白酶量開始減少，蛋白酶活力也在大幅度降低[21]。所以初步確定，米曲霉產酶的最佳發(fā)酵溫度為31℃。

2.4 發(fā)酵時間對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

發(fā)酵時間對米曲霉蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對米曲霉酶活力的影響Fig.3 Effect of ferment time on enzyme activity of soy sauce koji

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，米曲霉利用營養(yǎng)物質不斷地生長繁殖，使核桃粕中的蛋白酶活力積累增加，并在48 h時達到最大值，酶活力為1 254.67 U/g[22]。超過48 h之后，米曲霉分解蛋白質產生的氨基酸、多肽等胞外蛋白質開始大量積累，蛋白酶活力出現(xiàn)下降趨勢[23]。此時核桃粕中的淀粉酶活性也較高。而淀粉的水解產物葡萄糖等對霉菌產蛋白酶的阻礙作用也會導致蛋白酶活力先增加后減小[24]。所以在核桃粕中，米曲霉產酶的最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.5 米曲霉添加量對核桃粕中蛋白酶活力的影響

米曲霉添加量對其蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 米曲霉添加量對米曲霉酶活力的影響Fig.4 Effect of Aspergillus oryzae addition on enzyme activity of soy sauce koji

由圖4可知，隨著米曲霉添加量的增加，核桃粕中的蛋白酶活力先升高后降低，當米曲霉添加量為0.015%時，蛋白酶活力達到最大值（1 340.00 U/g），說明此時米曲霉的數(shù)量與營養(yǎng)物質恰好達到平衡，產生的蛋白酶最多。當米曲霉添加量大于0.015%時，蛋白酶活力開始下降。從理論上講，添加量過大可使出發(fā)菌體的數(shù)量增加，但也會加大原料中可利用營養(yǎng)物質的競爭，使個體菌體的生長狀況不佳，影響孢子的成熟，最終影響蛋白酶的誘導產生[18]。所以確定，當米曲霉添加量為0.015%時，核桃粕中的蛋白酶活力最高。

2.6 通風量對米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

按照1.3.4.5的方法，對兩種發(fā)酵核桃粕進行蛋白酶活力的測定發(fā)現(xiàn)，在其他因素相同的條件下，經過通風處理的核桃粕蛋白酶活力為585.00 U/g，而未經通風處理的核桃粕蛋白酶活為858.00 U/g，其氨基酸態(tài)氮的含量也明顯高于前者。因為本次試驗是在實驗室中進行，每次試驗所選用的物料較少，并且在發(fā)酵的過程中采用的是薄層培養(yǎng)，使得米曲霉具有充足的氧氣，而通風會過多的帶走物料中的水分與熱量，使物料水分下降加快，從而影響到米曲霉蛋白酶的分泌。

2.7 正交試驗結果與分析

為了獲得米曲霉在核桃粕中的最佳產酶條件，在單因素試驗的基礎上，優(yōu)選發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時間這3個因素，探究其對米曲霉在核桃粕中發(fā)酵產蛋白酶活力的影響，正交試驗設計與結果見表4，方差分析見表5。

表4 L9（34）正交試驗設計與結果Table 4 L9（34）orthogonal test design and results

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，各因素對核桃粕中蛋白酶活力的影響程度依次為A＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞米曲霉添加量。最優(yōu)組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度為31℃、米曲霉添加量為0.015%、發(fā)酵時間為50 h，而此最優(yōu)組合與k值最優(yōu)A2B3C3進行驗證試驗作對比發(fā)現(xiàn)，A2B2C3所對應的蛋白酶活力為1 187.20 U/g，而A2B3C3所對應的蛋白酶活力為867.00 U/g。因此，選擇A2B3C3作為最佳產酶條件。

由表5可知，在所設計的因素范圍內，A、B、C的P值均小于0.01，說明發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時間對核桃粕中蛋白酶活力的大小均有極顯著影響。

2.8 米曲霉在核桃粕與豆粕中蛋白酶活力的比較

豆粕也是一種重要的植物性蛋白原料，其蛋白質含量一般為30%～50%，富含氨基酸且必需氨基酸平衡性好[25]。近年來大豆粕在加工利用及其實際應用方面都取得了很大的進展，所以本文按照正交試驗中的最佳產酶條件，對核桃粕和豆粕進行發(fā)酵處理后，對其中所含的蛋白酶活力進行比較。圖5為核桃粕發(fā)酵后物料外觀，圖6為豆粕發(fā)酵后物料外觀。

圖5 28 h和50 h不同時間段核桃粕發(fā)酵外觀圖Fig.5 Appearance diagram of walnut meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h

圖6 28 h和50 h不同時間段豆粕發(fā)酵外觀圖Fig.6 Appearance diagram of soybean meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h

從圖5中可以看出，米曲霉在核桃粕中長勢良好，在發(fā)酵前期，米曲霉以生長白色菌絲為主，隨著時間的延長，米曲霉孢子大量繁殖，呈現(xiàn)為明顯的黃綠色微小顆粒。最終測得核桃粕中的蛋白酶活力為1 225.40 U/g，豆粕中的蛋白酶活力為434.80 U/g，核桃粕中的蛋白酶活力要明顯高于豆粕中的蛋白酶活力。以此說明，與豆粕相比，米曲霉更適宜在核桃粕發(fā)酵。

3 結論

核桃粕是一種優(yōu)質植物蛋白的重要來源，但目前卻被用作生產價值低廉且不可食用的飼料和肥料，造成了蛋白資源的極大浪費。所以對核桃粕進行酶解發(fā)酵，對促進核桃資源的高效利用具有重大意義。本文通過單因素和正交試驗確定了米曲霉在核桃粕中發(fā)酵的最佳產酶條件：發(fā)酵溫度為31℃，米曲霉添加量為0.015%，發(fā)酵時間為50 h，這3個因素對核桃粕中蛋白酶活力的大小均有極顯著影響。在此最佳條件下培養(yǎng)，菌種表現(xiàn)出的蛋白酶活力為1 187.20 U/g。并且在最優(yōu)條件下，對核桃粕和豆粕進行發(fā)酵處理，對比發(fā)現(xiàn)，米曲霉在核桃粕中的蛋白酶活力要明顯高于豆粕中的蛋白酶活力。