劉猛,吳偉源,章檢明,王小佳
(1.呂梁學院生命科學系,山西 呂梁 033000;2.山西省特色植物功能成分工程研究中心,山西 呂梁 033000;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所,浙江 杭州 310016)
核桃青皮,來源于核桃成熟后剝落的一層厚厚的綠色外皮,屬于核桃的加工副產(chǎn)物。其油脂中含有大量不飽和脂肪酸[1],含有很多對身體有益的油酸和亞油酸[2-3]。有研究指出核桃青皮在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、色素方面具有重要的使用價值[4],利用核桃青皮中的活性成分,對研發(fā)天然的植物性抗氧化劑具有重要的作用[5]。多酚類物質是天然的抗氧化成分,在一定條件下,其抗氧化能力隨著多酚含量的增加而提高[6]。本試驗使用甲醇對核桃青皮進行提取,利用不同體積分數(shù)的甲醇溶液,獲得核桃青皮內的活性成分,并對提取液進行體外抗氧化實驗,闡明其抗氧化活性差異,更好地發(fā)揮核桃青皮的研究價值和經(jīng)濟價值。
相關研究指出,核桃青皮富含多酚類、萘醌苷類和色素類化合物等功能成分[7-8]。田平平等[9]通過已醇提取核桃青皮,得到了槲皮素-3-O-葡萄糖苷、鞣花和表兒茶素等7種抗氧化活性的主要成分。張衛(wèi)星等[10]發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯和氯仿溶液對核桃青皮進行提取,二者的提取液對DPPH自由基清除能力及還原力很強,表現(xiàn)出與多酚物質或功能組分含量有一定的正相關關系。呂建平等[11]發(fā)現(xiàn)當料液比為1∶18(g/mL)時,活性物質中多糖提取率為9.02%,其對羥基自由基清除率低于維生素C,同樣,對超氧陰離子自由基清除率也沒有維生素C效果好,但均具有一定的清除效果。在核桃青皮的化學成分研究中,甙類物質可以減輕癥狀、緩解疼痛、提高食欲、助于睡眠,丹寧類物質可用于工業(yè)做染色劑和固色劑[4]。醇提取是一種常見的預處理方式,甲醇的分子極性比乙醇分子極性大,所以核桃青皮經(jīng)甲醇溶液提取后研究其抗氧化活性,為研發(fā)天然的抗氧化劑提供了一定的參考。
核桃(含青皮,食品級):市售;硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林酚、無水乙醇、無水甲醇、鐵氰化鉀、三(羥甲基)氨基甲烷、三氯化鐵、三氯乙酸、無水碳酸鈉(均為分析純):福晨(天津)化學試劑有限公司;沒食子酸(分析純):大茂(天津)化學試劑有限公司;鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(均為分析純):飛凈(福州)生物科技有限公司。
DK-98-II恒溫水浴鍋:泰斯特(天津)儀器有限公司;AC 100-240 V磁力攪拌器、MC-4 K型低速離心機:群安(寧波)試驗儀器有限公司;FA 214型電子天平(千分之一):豪晟(上海)科學儀器有限公司;DSA 100-GL 2-4.0 L超聲波清洗儀:德森精工有限公司;EPOCH 2酶標儀:伯騰(美國)儀器有限公司;PHS-3 CU pH計:越平(上海)儀器有限公司;101型電熱鼓風干燥箱:科偉永興(北京)儀器有限公司。
1.3.1 核桃青皮提取物的制備
取適量自然晾干的核桃青皮,50℃烘干至恒重后粉碎、過80目篩后,避光保存,備用。稱取1 g核桃青皮粉,按料液比1∶10(g/mL)分別加入 0%、20%、40%、60%、80%甲醇,在30℃條件下超聲30 min,靜置12 h,4 000 r/min,離心10 min后取上清液,即得核桃青皮提取液,避光保存[12]。
1.3.2 多酚含量的測定
參考鄭渝川等[13]和張?zhí)熵數(shù)萚14]的方法中福林酚比色法測定多酚含量。
1.3.3 核桃青皮提取液抗氧化活性的測定
1.3.3.1 核桃青皮提取液還原力的測定
核桃青皮提取液還原力的測定采用普魯士藍法[15],稍作修改。取50 μL的不同甲醇濃度提取液,分別加入125 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液,混勻后,45℃水浴25 min,快速冷卻至室溫25℃,加入125μL 10%三氯乙酸終止反應。4 000r/min離心10min后,取125μL上清液,加入125μL蒸餾水和25μL0.1%三氯化鐵溶液,搖勻,室溫25℃放置10 min。在700nm處測吸光度,記為A700nm,其吸光度反映了還原力的大小。
1.3.3.2 羥基自由基清除率的測定
參照文獻[16]的方法,稍作修改。取濃度為9.0mmol/L FeSO4溶液50 μL,加入9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液50 μL,再加入不同甲醇濃度提取液 50 μL,最后加入8.8mmol/LH2O2溶液50μL,搖勻后在37℃反應30min,在波長510 nm處測定吸光度A1,按照上述相同方法,使用蒸餾水替代樣品溶液,測定A0,使用蒸餾水替代過氧化氫,測定A2。由公式(1)計算出羥基自由基清除率。
式中:A0為空白溶液吸光度;A1為加入樣品后的吸光度;A2為不加顯色劑的吸光度。
1.3.3.3 DPPH自由基清除能力的測定
參考文獻[12,17-18]的方法,稍作修改。將不同樣品稀釋為1 mg/mL,取50 μL 1 mg/mL不同樣品溶液和50 μL 0.1 mmol/LDPPH溶液,混勻后在室溫25℃下避光靜置30 min,用酶標儀在517 nm處測定吸光度(A)。每個樣品重復測定3次,結果取平均值。由公式(2)計算出DPPH自由基清除率。
式中:A1為加入提取液后DPPH的吸光度;A2為同等量的無水乙醇代替DPPH溶液后的吸光度;A3為DPPH溶液的吸光度。
1.3.3.4 超氧陰離子自由基清除率的測定
參考文獻[19-20]方法稍作修改。依次向試管中加入50 mmol/L的Tris-HCl溶液(pH 值為8.2)225 μL,在25℃的水浴鍋中保溫20 min,加入50 μL樣品溶液,再加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液20 μL,快速混勻,放入25℃的水浴鍋中5 min,立即加入8 mol/L鹽酸溶液50 μL終止反應。在325 nm處測定吸光度A1。用去離子水代替鄰苯三酚,測定A2,用去離子水代替樣品溶液做空白參照,測定A3。由公式(3)計算得出超氧陰離子自由基清除率。
式中:A1為加入鄰苯三酚溶液后的吸光度;A2為加入離子水后的吸光度;A3為空白溶液吸光度。
數(shù)據(jù)采用Origin9.1軟件進行計算繪圖。采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,p<0.05為顯著性差異。
不同甲醇濃度提取液對多酚含量的影響如圖1所示。
圖1 不同甲醇濃度提取液中多酚含量Fig.1 Polyphenol content in extracts under different methanol concentrations
由圖 1可知,0%、20%、40%、60%、80%甲醇提取液中多酚濃度分別為88.692、95.801、70.866、64.633、46.697 μg/mL,且隨著濃度升高有顯著性差異。當甲醇濃度為0%~20%時,提取液中多酚含量逐漸增加,20%甲醇提取效果最好,多酚含量最高,繼續(xù)增加甲醇濃度后,提取液中多酚含量逐漸下降,80%甲醇提取效果最差,多酚含量最低。因此,當采用20%甲醇進行提取時,得到的提取液多酚含量最高。
2.2.1 不同甲醇濃度提取液對還原力的影響
不同甲醇濃度的提取液的還原力大小如圖2所示。
圖2 不同甲醇濃度提取液的還原力比較Fig.2 Comparison of reducing power of extracts under different methanol concentrations
由圖 2可知,0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的還原力分別為0.692、0.678、0.524、0.524、0.515。利用不同甲醇濃度溶液對核桃青皮進行提取,隨著甲醇溶劑濃度的增加,提取液的還原力逐漸下降,其中0%與20%的甲醇提取液還原力相比無顯著性差異,40%、60%和80%甲醇提取液的還原力相互之間無顯著性差異。以0%的甲醇提取液還原力最高。
2.2.2 不同甲醇濃度提取液對羥基自由基的清除率的影響
不同甲醇濃度提取液對羥基自由基清除率的影響如圖3所示。
圖3 不同甲醇濃度提取液的羥基自由基清除率比較Fig.3 Comparison of OH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
由圖 3可知,0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的羥基自由基清除率分別為59.09%、61.18%、59.37%、53.93%、41.33%。隨著甲醇溶劑濃度的增加,提取液的羥基自由基清除率先上升后下降。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羥基自由基清除率相互之間無顯著性差異,但是與80%甲醇提取液相比均有顯著性差異。以20%甲醇提取液的羥基自由基清除率最高。
2.2.3 不同甲醇濃度提取液對DPPH自由基清除率的影響
不同甲醇濃度的提取液對DPPH自由基清除率的影響如圖4所示。
圖4 不同甲醇濃度提取液的DPPH自由基清除率比較Fig.4 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
由圖4可知,不同甲醇濃度提取液的DPPH自由基的清除率分別為72.26%、96.18%、86.01%、87.28%、91.35%。其中0%與20%和80%甲醇提取液的羥基自由基清除率有顯著性差異,但40%與60%甲醇提取液與其他組相比均不具有顯著性差異。20%甲醇提取液對DPPH自由基的清除效果最好;DPPH自由基的清除率最低的是0%甲醇提取液。
2.2.4 不同甲醇濃度提取液對超氧陰離子自由基的清除率的影響
不同甲醇濃度提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響如圖5所示。
由圖 5可知,0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的超氧陰離子自由基清除率分別為43.27%、46.06%、47.39%、46.67%、24.85%。當甲醇濃度為0%~40%時,提取液的超氧陰離子自由基清除率逐漸增加,40%甲醇提取液的清除率最高;繼續(xù)增加甲醇濃度后,提取液的超氧陰離子自由基清除率逐漸下降,80%甲醇提取液的清除率最低。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羥基自由基清除率相互之間無顯著性差異,但是與80%甲醇提取液相比均有顯著性差異。以40%的甲醇提取液的超氧陰離子自由基清除率最高。
圖5 不同甲醇濃度提取液的超氧陰離子自由基清除率比較Fig.5 Comparison of O2-free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
以核桃青皮為原料,采用不同甲醇濃度進行提取,測定了多酚含量、羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率、還原力等抗氧化活性指標,最終闡明不同甲醇濃度提取液抗氧化活性間的差異。經(jīng)研究得出,核桃青皮以20%甲醇為提取劑時多酚濃度最高,而80%甲醇提取劑多酚濃度最低。核桃青皮提取液的羥基自由基清除能力與提取液中的多酚含量相關,以20%甲醇溶液提取效果最好。隨著甲醇溶劑濃度的增加,提取液的還原力逐漸下降,其還原力與提取溶劑濃度成負相關,以0%甲醇提取的還原力最高。而DPPH自由基清除能力和甲醇濃度無線性關系,不同甲醇濃度提取液中以20%甲醇提取對DPPH清除能力最高,不同濃度提取液中40%甲醇提取對超氧陰離子自由基清除能力最高。由此得出結論,20%甲醇提取液抗氧化活性最佳。