李燕思，劉 梅，許桂麗，尹瓊玉，魯 毅

（東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥學部,江蘇 南京 210002）

復方絞股藍袋泡茶為東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院院內制劑［制字（2016）F516004］，由絞股藍、決明子、三七花三種中藥材組成，處方中三種藥材比例為3∶5∶2。該制劑具有清熱平肝、化瘀祛濕的功效，可用于高血脂、高血壓的輔助治療。方中絞股藍為葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllumMakino 的干燥地上部分，具有清熱解毒、止咳祛痰、生津安神等作用，廣泛應用于心腦血管、腫瘤等疾病的治療［1-2］。研究表明，絞股藍中含有多種皂苷、黃酮、多糖等化學成分，目前對其有效成分的研究多集中在皂苷成分，而對另一類活性成分黃酮關注較少［3-4］。研究表明，黃酮類化合物具有顯著的生理活性，如抗氧化、清除氧自由基、改善心腦血管循環(huán)和調節(jié)血壓等［5-6］?；诖耍驹囼灢捎肏PLC 法測定復方絞股藍袋泡茶中黃酮類成分槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，為全面有效控制該制劑的質量提供參考和依據(jù)。

1 實驗材料

1.1儀器 SPD10A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA-2004N 電子天平（上海精科實業(yè)有限公司）；CPA225D電子天平（德國賽多利斯股份公司）。

1.2試藥 槲皮素（批號：100081-200406）、山柰素（批號：110861-201611）、異鼠李素對照品（批號：110860-200608），均購自中國藥品生物制品研究所；復方絞股藍袋泡茶（每袋3.0 g，本院制劑室自制）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：360 nm；進樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按槲皮素、山柰素、異鼠李素峰計算應不低于5 000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成槲皮素、山柰素、異鼠李素濃度分別為28.3 μg/ml、31.6 μg/ml、22.4 μg/ml 的混合溶液，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品裝量差異項下的內容物，混合均勻，研細，精密稱定3.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇20 ml、25%鹽酸溶液5 ml，搖勻，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉移至50 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按處方比例制備缺絞股藍藥材的陰性制劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μl，按以上色譜條件進樣分析，結果待測的三種成分與相鄰色譜峰的分離度均＞2，能達到較佳的分離效果，且陰性對照溶液對測定無干擾。對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）、供試品（B）、陰性對照（C）HPLC色譜圖

2.4線性關系考察 分別取槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為71.26 μg/ml、79.37 μg/ml、48.40 μg/ml 的混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液各1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密稱取系列溶液各10μl，按“2.1”項下方法進樣檢測，測定峰面積。以峰面積為縱坐標Y，以對照品進樣量（μg）為橫坐標X，繪制標準曲線。槲皮素、山柰素、異鼠李素的回歸方程分別為：Y=4.2×106X-37 975（r=0.999 8）、Y=4.3×106X-68 611（r=0.999 5）、Y=4.1×106X-19 226（r=0.999 7），結果表明槲皮素在0.071～0.570μg、山柰素在0.079～0.635 μg、異鼠李素在0.048～0.387 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項混合對照品溶液10μl，按“2.1”項下方法檢測，連續(xù)進樣6次，測出槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.26%、1.08%、1.31%（均n=6），結果表明精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號為170213），分別于0 h、8 h、16 h、24 h、48 h進樣10μl，按上述條件測定峰面積，結果槲皮素、山柰素、異鼠李素RSD 分別為1.72%、1.06%、0.98%（均n=6），表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.7重復性試驗 精密稱取同一供試品（批號為170213），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下方法依次測定，計算得出槲皮素、山柰素、異鼠李素含量，RSD 分別為1.54%、1.16%、1.63%（均n=6），結果表明重復性良好。

2.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號為170213）1.5 g，精密加入一定濃度的槲皮素、山柰素、異鼠李素混合對照品溶液各1 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下方法檢測，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 （n=5）

2.9樣品含量測定 取3 批復方絞股藍袋泡茶樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算得槲皮素、山柰素、異鼠李素含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果 （n=3，mg/g）

3 討 論

3.1定量物質的選擇 絞股藍是復方絞股藍袋泡茶的主要藥物，其黃酮成分含量為2%～5%［4］。黃酮作為植物體內次生代謝產物之一，其主要功能為調節(jié)植物生長素的運輸，且具有多種生物活性［5-7］。本研究選擇以絞股藍中黃酮類成分槲皮素、山柰素、異鼠李素為定量成分，能對復方絞股藍袋泡茶的質量進行有效控制。

3.2供試品提取方法的選擇 參考相關文獻［8］及《中華人民共和國藥典》中槲皮素等黃酮醇苷的提取方法［9］，選擇以甲醇∶鹽酸（體積比4∶1）為溶劑，鹽酸濃度分別設為15%、25%、35%，采用加熱回流提取供試品。結果顯示，提取率隨鹽酸濃度增高而增高，但鹽酸濃度不宜過高，否則將對高效液相進樣閥和色譜柱有腐蝕，最終采用甲醇∶25%鹽酸（體積比4∶1）為溶劑對供試品進行提取。

3.3流動相的選擇 參考文獻［10］中流動相的選擇，槲皮素、山柰素、異鼠李素與其他成分分離效果不佳。后根據(jù)待測成分的特點，并參考文獻［11-12］，適當提高磷酸水溶液比例，選用甲醇-0.4%磷酸（50∶50）作為流動相，待測的三種成分與相鄰色譜峰的分離度均＞2，能達到較佳的分離效果。

本實驗采用HPLC 法測定復方絞股藍袋泡茶中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，方法簡單、準確、重現(xiàn)性好，可用于復方絞股藍袋泡茶的含量測定和質量控制。