韓 勇 李 英 劉玉潔

1.山東省日照市動物疫病預防控制中心，山東日照 276800；2.山東省日照市五蓮縣叩管畜牧獸醫(yī)獸醫(yī)站，山東五蓮 262300

2021年8月2日，山東畜牧獸醫(yī)局印發(fā)《山東省重點動物疫病監(jiān)測凈化工作方案（2021 版），要求推進全省重點動物疫病監(jiān)測凈化，提高規(guī)模養(yǎng)殖場管理水平和疫病防控能力，推動動物疫病防控從穩(wěn)定控制到凈化消滅轉(zhuǎn)變。2021年10月7日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)《關于推進動物疫病凈化的意見》，要求推進動物疫病凈化工作，力爭通過5年時間，在全國建立一批高水平的凈化場。日照市種禽場較多，既有地方優(yōu)良品種日照麻雞，又有國外白羽肉雞，凈化任務艱巨。日照麻雞是山東省地方優(yōu)良品種，原產(chǎn)于日照市東北部兩城鎮(zhèn)一帶，山東省膠南市瑯琊鎮(zhèn)一帶也有分布，因此也稱“瑯琊雞”。日照麻雞抗病力強、耐粗飼、肉質(zhì)風味好、產(chǎn)蛋多，屬肉蛋兼用型品種，深受廣大消費者的歡迎。1978年，被列為山東地方家禽良種，2009年被山東省畜牧獸醫(yī)局列入《山東省畜禽遺傳資源保護名錄》[1]。經(jīng)過多年的保種和推廣，日照麻雞現(xiàn)存原種1 萬余只，祖代雞5萬套，年產(chǎn)父母代雞苗120 萬套，配套品種接近20個。日照麻雞憑借其獨特的表現(xiàn)性狀和優(yōu)異的生產(chǎn)性能，產(chǎn)品銷往山東、河南、陜西、山西、江蘇、云南、貴州和四川等地，受到市場的廣泛認可。20 世紀八九十年代，由于外來品種的引進和雜交改良，日照麻雞感染禽白血病、雞白痢、支原體等垂直傳播病的病例報道逐漸增多，凈化工作刻不容緩。另外，日照市白羽肉雞種禽場也較多，2020年白羽肉雞飼養(yǎng)量達到3 000 萬只，白羽肉雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但禽白血病等帶來的疫病威脅不容忽視。因此，做好白羽肉雞的疫病凈化工作尤為重要。

為從源頭上控制疫病，保護和振興地方雞種資源，2019年起，日照動物疫病預防控制中心選擇日照麻雞種雞場3 家，白羽肉雞父母代場1 家，按照國家和省的要求開展規(guī)模雞場主要疫病凈化工作，推動疫病從有效控制向凈化消滅轉(zhuǎn)變。本試驗通過3年持續(xù)監(jiān)測，了解日照市種雞場禽白血病、雞白痢、支原體主要病原感染狀況，以期為凈化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品類型和數(shù)量

2019年起，選擇日照麻雞種雞場3 家，包括原種、祖代和父母代各1 家，選擇白羽肉雞父母代場1家，每年開展2 次監(jiān)測。原種場按照置信水平95%，預期流行率3%，每次采樣不少于100 份。祖代場按照置信水平95%，預期流行率6%，每次采樣不少于50 份。父母代場按照置信水平95%，預期流行率10%，每次采樣不少于30 份。樣品來源每個種雞場不少于4 棟雞舍的雞只，種公雞、開產(chǎn)母雞和后備雞要兼顧一定比例。每只雞采集血清、鼻腔拭子、蛋清，編號一一對應。

1.2 樣品采樣和處理方法

1）血清。用促凝血管采集全血2 mL，室溫靜置30 min 以上，待析出血清后，3 000 r/min 離心3～5 min，將血清0.5 mL 取出放置1.5 mL 離心管內(nèi)，做好編號。

2）棉拭子。將1～1.2 mL PBS 緩沖液滴入1.5 mL離心管，將棉簽插入口腔、鼻腔內(nèi)部，來回旋轉(zhuǎn)3～4次，將沾取黏液的棉棒放入離心管內(nèi)，棉簽頭折斷將離心管蓋上，離心管中靜置過夜，浸出液上清進行試驗，采集口腔和鼻腔雙拭子，將拭子放置一個離心管內(nèi)，每只雞采集的棉拭子和血清一一對應。

3）蛋清。將雞蛋固定放好，用酒精擦拭后在一側(cè)打孔，用無菌移液槍頭或針管吸取適量蛋清，注意不要碰到蛋黃。每枚雞蛋吸取2 管蛋清，每管吸取0.5 mL 于1.5 mL 離心管內(nèi)，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)備用，試驗前需反復凍融3 次。每只雞采集的棉拭子和血清、蛋清一一對應。

1.3 檢測方法和試劑

支原體熒光RT-PCR 檢測試劑盒購自北京世紀元亨公司。雞白痢抗原購自青島立見公司，禽白血病p27 抗原、J 抗體、A/B 抗體均購自愛德士公司，雞毒、滑液囊支原體抗體ELISA 試劑盒均購自荷蘭百測公司。

1.4 主要儀器設備

核酸提取儀是西安天隆公司、實時熒光PCR 儀是美國ABI 公司、酶標儀購自美國MD 公司、離心機購自Sigma 公司等。

1.5 方 法

采集的鼻腔和口腔雙拭子提取病毒核酸，采用熒光定量PCR 方法，檢測支原體病原。采集血清進行禽白血病p27 抗原、J 抗體、A/B 抗體ELISA 檢測，采集的血清進行支原體ELISA 試驗，雞白痢抗體檢測采用平板凝集試驗。試驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份感染情況

2019-2021年連續(xù)3年監(jiān)測，禽白血病、雞白痢、支原體場陽性率總體呈下降趨勢，表明凈化取得顯著成效。日照市種雞場禽白血病感染類型主要是J 型，其次是A/B 型。4 個種雞場均檢測到禽白血病、雞白痢、支原體，禽白血病、雞白痢凈化效果高于支原體。雖經(jīng)過監(jiān)測凈化，但滑液囊支原體和雞毒支原體場陽性率均較高（表1）。

表1 2019-2021年場病原學陽性率統(tǒng)計%

2.2 種雞場感染情況

2019-2021年連續(xù)監(jiān)測顯示，4 個種雞場禽白血病、雞白痢、支原體個體陽性率總體呈下降趨勢，凈化效果明顯。原種場禽白血病、雞白痢、支原體的個體陽性率低于祖代場，祖代場禽白血病、雞白痢、支原體的個體陽性率低于父母代場。日照麻雞原種場經(jīng)過3年凈化監(jiān)測，2021年未檢測到禽白血病、雞白痢和支原體病原，凈化取得顯著成效。但檢測的1 個祖代和2 個父母代場禽白血病、雞白痢和支原體感染依然嚴重，尤其支原體污染面較廣，個別種雞場個體陽性率達到10%，應引起重視（表2）。

表2 日照市種雞場主要疫病個體陽性率%

3 討 論

3.1 凈化總體情況

日照市自2019年以來，在全市選擇4 家種禽場開展主要禽病凈化工作。經(jīng)過3年的連續(xù)凈化監(jiān)測，禽白血病、雞白痢、支原體場和個體總體陽性率均呈下降趨勢，凈化取得了一定成效。其中，日照麻雞原種場凈化效果尤其明顯，2021年未檢測到禽白血病、雞白痢和支原體病原。

陳靜等[2]對山東五大優(yōu)質(zhì)地方名雞檢測發(fā)現(xiàn)，目前困擾山東地方雞的ALV 主要為ALV-J；蘆花雞與瑯琊雞群中存在ALV-A、ALV-J 的共感染。本試驗監(jiān)測結(jié)果也顯示，日照麻雞感染的禽白血病主要以J-ALV 為主，其次是A/B-ALV。禽白血病、雞白痢和支原體是垂直傳播疫病，能通過垂直傳播至下一代，引起雞只生產(chǎn)性能下降、生長緩慢等癥狀，造成更大范圍的感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。本試驗通過3年的凈化監(jiān)測，2021年4 個種雞場有3 個未檢測到禽白血病和雞白痢，但支原體的感染仍較嚴重，給種雞場帶來較大的經(jīng)濟損失，應引起足夠重視。

3.2 地方品種日照麻雞感染較嚴重

日照麻雞作為山東優(yōu)良地方品種，經(jīng)過多年的保種和推廣，日照麻雞現(xiàn)存原種1 萬余只，祖代雞5萬套，配套品種接近20 個。20 世紀八九十年代，由于外來品種的引進和雜交改良，地方品種雞感染禽白血病、雞白痢、支原體的病例報道逐漸增多，楊鳳等[3]在山東采集255 份蘆花、日照麻雞等地方品種，P27 抗原陽性率為50.98%，采集41 份病料用PCR檢測，33 份呈ALV-J 陽性（80.49%）。羊揚等[4]選擇腿病發(fā)病較少的3 個黃羽肉雞養(yǎng)殖公司的肉雞場采樣，于2018年6月進行采樣，滑液囊支原體（MS）抗體陽性率均高于80%。本試驗檢測結(jié)果也顯示，日照麻雞種雞場禽白血病、雞白痢、支原體感染較嚴重，尤其支原體感染率較高，個別場個體陽性率達到10%，對保種構(gòu)成較大威脅，需加大凈化力度。

3.3 白羽肉雞感染情況

據(jù)韓雪等[5]報道，部分飼養(yǎng)進口品種的雞場也有禽白血病抗原或抗體檢出，進口品種的引種控制和陰性雞群的凈化維持仍需要加強。白羽肉雞在日照市飼養(yǎng)量較大，課題組選取1 家白羽肉雞種雞場開展凈化，成效顯著。2019-2021年連續(xù)3年監(jiān)測凈化顯示，禽白血病、雞白痢、支原體的陽性率總體呈下降趨勢，但支原體的感染仍嚴重，需繼續(xù)加強管理和防控，做好凈化工作。

3.4 下一步工作重點

經(jīng)過3年持續(xù)監(jiān)測凈化，4 個種雞場禽白血病、雞白痢、支原體陽性率總體呈下降趨勢，尤其禽白血病和雞白痢凈化成效顯著，仍需加大凈化力度。4個種雞場支原體的感染較嚴重，個別種雞場個體陽性率達到10%。支原體往往因治療不力而繼發(fā)大腸桿菌感染，導致患病雞體自身黏膜屏障保護力降低，造成免疫失敗，繼而誘發(fā)禽流感和新城疫等疫病，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大經(jīng)濟損失。支原體除可水平傳播外，還可垂直傳播[6-7]，危害嚴重，應作為日照市下一步規(guī)模種雞場凈化的重點疫病。