黃裕游，何雪芳

廣東省汕尾市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東汕尾 516600

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)是確診新型冠狀病毒肺炎的首要標(biāo)準(zhǔn)[1]，核酸提取作為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的預(yù)處理步驟，提取產(chǎn)物的質(zhì)量對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有很大影響。根據(jù)《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南：CNAS-GL039:2019》[2]，提取試劑的驗(yàn)證需要進(jìn)行核酸純度、核酸提取產(chǎn)率及核酸完整性驗(yàn)證。本研究因條件限制，采用一種間接方法，即使用已知濃度的驗(yàn)證樣本用待評(píng)價(jià)提取試劑進(jìn)行提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較分析所得到的結(jié)果，從而對(duì)待評(píng)價(jià)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 選用廣州和信生物科技有限公司提供的新型冠狀病毒室內(nèi)質(zhì)控品作為驗(yàn)證樣本，該質(zhì)控品由國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心研發(fā)，廣州和信生物科技有限公司生產(chǎn)，并通過(guò)數(shù)字 PCR技術(shù)對(duì)質(zhì)控品進(jìn)行定量，選用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為新型冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)091090，檢測(cè)試劑使用上海之江生物科技股份有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑，待評(píng)價(jià)提取試劑盒為市面上4種品牌的磁珠法核酸提取試劑盒，包括上海之江生物科技股份有限公司(A)、重慶中元生物技術(shù)有限公司(B)、廣州和信生物科技有限公司(C)及杭州博日科技有限公司(D)。提取儀器使用提取試劑盒專(zhuān)用或廠家配制儀器，產(chǎn)物擴(kuò)增使用杭州博日科技有限公司LineGene 9600 Plus熒光定量PCR儀。

1.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)，靶基因熒光通道Ct值≤43，且擴(kuò)增曲線呈典型S型，則判斷為靶基因陽(yáng)性，結(jié)果判斷見(jiàn)表1。有研究證明，Ct值大小與樣本中的原始拷貝數(shù)呈反比[3]，Ct值越小可反映出提取液中靶基因模板濃度越高。

表1 擴(kuò)增結(jié)果判斷

1.3 方法 根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)(試行第二版)》[4]要求，檢測(cè)試劑的檢出限為≤500 copy/mL，弱陽(yáng)性質(zhì)控為試劑檢測(cè)限的1.5～3.0倍，故本研究樣本最高濃度設(shè)定為文件要求弱陽(yáng)性的最高濃度1 500 copy/mL，最低濃度設(shè)定為本研究使用的檢測(cè)試劑的檢出限為200 copy/mL，中間取1 000 copy/mL及500 copy/mL兩種濃度梯度。用去離子水對(duì)1 500 copy/mL的質(zhì)控原液按一定比例稀釋至1 000、500、200 copy/mL，每種濃度梯度配置成5個(gè)樣本進(jìn)行提取，再將每份提取產(chǎn)物平行進(jìn)行3次擴(kuò)增，得到15個(gè)擴(kuò)增結(jié)果，最后將結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 4種品牌在不同濃度樣本中檢測(cè)結(jié)果比較 按檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)結(jié)果的判定方法對(duì)所有檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，見(jiàn)表2。A品牌在500 copy/mL及200 copy/mL的樣本中均有可疑陽(yáng)性結(jié)果；B品牌在500 copy/mL的樣本中出現(xiàn)可疑陽(yáng)性結(jié)果；C品牌在各種濃度樣本中均有可疑陽(yáng)性結(jié)果，在1 500 copy/mL及200 copy/mL的樣本中出現(xiàn)陰性結(jié)果；D品牌在各種濃度樣本中結(jié)果均為陽(yáng)性。

表2 4種品牌在不同濃度樣本中檢測(cè)結(jié)果比較(%)

2.2 4種品牌在不同濃度樣本中基因檢出率比較 使用A、B、D品牌提取試劑提取核酸后擴(kuò)增結(jié)果中，ORF1ab基因檢出率最高，均在93.33%以上；隨著樣本濃度降低，A、B、D 3個(gè)品牌總基因檢出率均有所下降，但均在80.00%以上；D品牌結(jié)果中，各靶基因漏檢不超過(guò)2個(gè)；C品牌結(jié)果中，不同靶基因漏檢率均較高，檢出率均小于或等于80.00%。見(jiàn)表3。

表3 不同提取試劑提取不同濃度樣本基因檢出率比較(%)

續(xù)表3 不同提取試劑提取不同濃度樣本基因檢出率比較(%)

2.3 擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較 A、B、D品牌在1 500 copy/mL濃度樣本中基因檢出率均為100.00%，故選取此濃度樣本的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行Ct值分析。A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.29，P<0.05)；A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值均大于B、D品牌，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C品牌各濃度樣本均存在靶基因漏檢，故不列入比較；B品牌批內(nèi)重復(fù)性最佳(CV最小)。見(jiàn)表4。 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.73，P<0.05)； A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值大于B品牌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D品牌批內(nèi)重復(fù)性最佳(CV最小)。見(jiàn)表5。A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值大于D品牌，D品牌大于B品牌，D品牌與A、B品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D品牌批內(nèi)重復(fù)性最佳(CV最小)。見(jiàn)表6。

表4 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較

表5 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較

表6 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴(kuò)增結(jié)果Ct值比較

3 討 論

自2019年新型冠狀病毒肺炎疫情暴發(fā)以來(lái)，國(guó)內(nèi)疫情已基本得到控制，但由于全球疫情的肆虐，國(guó)內(nèi)疫情防控依然嚴(yán)峻。2021年來(lái)，廣州、南京、張家界、鄭州等地仍出現(xiàn)小規(guī)模疫情暴發(fā)，而大規(guī)模人群核酸篩查在疫情防控中起非常重要的作用。RT-PCR目前作為新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的常規(guī)檢測(cè)手段之一，是靈敏度和特異度平衡較好的檢測(cè)技術(shù)[5]。核酸的提取與純化是RT-PCR的關(guān)鍵步驟之一，不同核酸提取方法提取質(zhì)量有一定差異。吳永彬等[6]研究結(jié)果顯示，磁珠法較裂解法和柱提法有更好的性能；楊超杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，手工過(guò)柱提取法耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法有效節(jié)約時(shí)間和人力成本，不推薦用于大規(guī)模樣本的篩查；張?jiān)汽惖萚8]研究顯示，免提取樣本釋放劑得到的結(jié)果重復(fù)性不如磁珠法好。磁珠法是近年來(lái)比較常用的核酸提取方法，具有簡(jiǎn)便、高效、提取濃度及純度較高等優(yōu)勢(shì)[9]，而且可以配套全自動(dòng)提取儀實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取，極大地節(jié)約了時(shí)間及人力成本。

馬雯等[10]通過(guò)不同濃度的驗(yàn)證樣本，對(duì)市面上4種核酸提取試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證，研究不同提取試劑盒提取的核酸產(chǎn)物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。本研究結(jié)果顯示，A、B、D品牌的提取試劑提取濃度較高的樣本，雖然擴(kuò)增結(jié)果的Ct值有一定差異，但對(duì)結(jié)果判斷的影響相對(duì)較小，不會(huì)出現(xiàn)可疑或陰性結(jié)果，而在濃度較低的樣本中，雖出現(xiàn)漏檢率，但依然沒(méi)有出現(xiàn)陰性結(jié)果，在實(shí)際工作中，通過(guò)復(fù)查即可得出陽(yáng)性結(jié)果。在1 500 copy/mL濃度樣本的Ct值比較中，B品牌各靶標(biāo)Ct值總體上低于A品牌，可認(rèn)為B品牌提取產(chǎn)物濃度較A品牌要高，提取產(chǎn)物濃度越高，靶基因的檢出率就越高，這也是B品牌在低濃度樣本靶基因檢出率高于A品牌的原因；B品牌與D品牌中ORF1ab及N基因的Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但D品牌結(jié)果的CV總體上要小于B品牌，使低濃度樣本中D品牌檢出率更高，結(jié)果更穩(wěn)定。C品牌的結(jié)果漏檢率非常大，在高、低濃度樣本中均有陰性結(jié)果出現(xiàn)，低濃度樣本檢出率高于高濃度樣本，可能是由于C品牌的提取試劑盒提取后的核酸模板并不適合使用上海之江生物科技股份有限公司檢測(cè)試劑進(jìn)行擴(kuò)增，使多數(shù)擴(kuò)增結(jié)果落在灰區(qū)從而影響靶基因檢出率。國(guó)內(nèi)有研究顯示，不同提取試劑與新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑搭配使用，其結(jié)果存在差異，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇合適提取試劑和檢測(cè)試劑搭配使用[10-13]。

《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)(試行第二版)》[4]中提到，應(yīng)選用擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒指定的核酸提取試劑和擴(kuò)增儀。而在現(xiàn)實(shí)工作中，由于許多基層實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件的限制，無(wú)法全部實(shí)現(xiàn)使用指定的檢測(cè)系統(tǒng)，這就使實(shí)驗(yàn)室使用自建檢測(cè)系統(tǒng)用于臨床樣本檢測(cè)前，對(duì)于由提取試劑、提取儀、擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀等組成檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行系列性能驗(yàn)證顯得十分必要。