馮倚帆，張 帥，劉志堅，宋子威，熊曉蕓

1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221002；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009

人乳頭瘤病毒(HPV)感染日益引起公眾的關(guān)注，PATEL等[1]基于對全世界32項研究的系統(tǒng)回顧分析發(fā)現(xiàn)，每年肛門-生殖器疣的發(fā)病人數(shù)為每10萬人就有160～289例。低危型HPV感染導致皮膚或黏膜疣狀突起，比如HPV6、11型易導致尖銳濕疣。有研究發(fā)現(xiàn)，美國每年有1 400 萬人確診感染HPV，意味著HPV的流行范圍接近8 000萬人。HPV某些高危型長期和反復(fù)感染是導致惡變(包括宮頸癌、陰莖癌、肛門癌、陰道癌、外陰癌等)最主要的因素[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，25%的頭頸鱗狀細胞癌與HPV感染有關(guān)[3]，60%的口腔鱗狀細胞癌主要原因是HPV16型長期感染[4]。而絕大多數(shù)宮頸癌病例均由HPV感染引起，中國約占全球?qū)m頸癌的1/3，中國2015年新增宮頸癌病例約98 900例[5]。依據(jù)《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明：CNAS-CL02-A009：2018》[6]和《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》[7]在基因擴增檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明，新試劑在實驗室應(yīng)用于臨床檢驗前要進行性能驗證，才能保證實驗室對該項目檢測的質(zhì)量控制。徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科微生物室新購的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒[江蘇碩世生物科技股份有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)]可檢測21種HPV亞型。為確定本實驗室新啟用試劑能達到試劑說明書上聲明的性能指標，滿足臨床檢測要求，保證檢測質(zhì)量，本研究對21種HPV亞型檢測試劑盒的準確度、最低檢測限、精密度、特異度及抗干擾能力等性能進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 江蘇碩世生物科技股份有限公司提供的24例標本，經(jīng)亞能生物膜雜交法實驗驗證其中19例陽性(涵蓋該試劑盒可檢測的21種亞型)和5例陰性；江蘇碩世生物科技股份有限公司提供的陽性參考品，主要成分為HPV21種亞型及參考基因質(zhì)粒；徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科微生物室、婦產(chǎn)科實驗室和皮膚科實驗室提供的白色念珠菌、大腸埃希菌及解脲支原體陽性標本，這些標本與HPV感染部位相同，癥狀相似，且不在該試劑盒檢測范圍內(nèi)。

1.1.2 儀器與耗材 SLAN-96P熒光定量PCR分析儀(購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；Eppendorf高速低溫離心機、Eppendorf金屬浴恒溫器、Eppendorf漩渦振蕩儀、八聯(lián)管(A～H)均購自美國Axygen公司。

1.1.3 試劑 來自江蘇碩世生物科技股份有限公司的核酸提取與純化試劑盒、人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒(熒光定量PCR)，可檢測21種HPV亞型，包括高危型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82、73型及低危型HPV6、11、81型。

1.2 方法

1.2.1 提取HPV核酸 取出標本，振蕩混勻，吸取500 μL標本于帶螺口的離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物。加入100 μL宮頸細胞標本裂解液，振蕩混勻，100 ℃水浴或干浴10 min。振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，上清液即為核酸溶液，加入反應(yīng)試劑就可直接用于檢測。

1.2.2 PCR 擴增參數(shù)：50 ℃ 5 min 尿嘧啶-N-糖基化酶處理；95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s變性，58 ℃ 40 s退火、延伸及檢測熒光，其中58 ℃時熒光檢測的檢測通道為FAM、VIC、ROX 3種熒光反應(yīng)，45個循環(huán)；儀器冷卻。PCR擴增結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束儀器可自動保存結(jié)果?？瞻讓φ諢o典型S型擴增曲線顯示；陽性對照HPV21種亞型及參考基因檢測呈典型S型擴增曲線，且Ct值≤30.0；參考基因H孔FAM通道擴增曲線呈典型S型曲線，且Ct值≤36.7。

1.2.3 性能驗證指標及驗證方法 (1 )準確度驗證。亞能生物膜雜交法試驗已檢測的24例標本(陽性19例和陰性5例)，嚴格按照HPV核酸提取和擴增程序進行試驗。將測定結(jié)果與已知結(jié)果進行比對，若檢測結(jié)果不一致，需采用金標準測序法進行驗證，符合率≥95%為合格。(2)最低檢測限。最低檢測限的驗證選擇該試劑公司的企業(yè)陽性參照物(濃度為107copy/mL)，進行10倍梯度倍比稀釋至試劑盒提供的最低檢測限為104copy/mL，重復(fù)檢測20次。檢測結(jié)果陽性率≥95%為合格。(3)精密度試驗。選擇該試劑公司的企業(yè)陽性參照物。批內(nèi)CV：在一個批次內(nèi)連續(xù)檢測做10個重復(fù)管，并計算Ct值的CV，參考《核酸擴增檢測用試劑(盒)：YY/T1182-2010》[8]，計算其CV≤5.00%為合格。批間CV：連續(xù)檢測5 d，每天重復(fù)4次，并計算Ct值的CV，參考文獻[9]計算其CV<5.00%為合格。(4 )特異度。采用該試劑盒檢測與HPV感染部位相同、癥狀相似的病原體及該試劑盒檢測范圍之外的物質(zhì)，白色念珠菌、大腸埃希菌和解脲支原體分別加入標本中，以陰性標本作為對照，按照核酸提取和擴增程序進行檢測。檢測結(jié)果顯示交叉反應(yīng)陰性為合格。(5) 抗干擾能力。將標本(HPV16型/HPV31型)均等分為5份，編號1～5，1號加入與干擾物質(zhì)等體積的TE緩沖液作為對照組，2～5號分別加入檢測標本中常見的干擾物[宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油(5%)]作為試驗組。按照核酸提取和擴增程序進行檢測，檢測結(jié)果為HPV16、31型檢出為驗證合格。

2 結(jié) 果

2.1 HPV亞型檢測試劑盒準確度驗證結(jié)果 24例標本中19例陽性標本試驗結(jié)果與已知結(jié)果均一致，符合率為100.00%，見表1。

表1 HPV分型檢測試劑盒準確度驗證結(jié)果

2.2 最低檢測限 該試劑盒的最低檢測限為104copy/mL，陰性率為100.00%，符合試劑盒聲明的最低檢測限，最低檢測限驗證合格。

2.3 精密度 21種HPV亞型和陽性參照物批內(nèi)CV為0.22%～3.40%，CV均小于5.00%，符合行業(yè)標準(CV≤5.00%)；21種HPV亞型和陽性參照物批間CV為0.31%～0.91%，CV均小于5.00%，符合行業(yè)標準(CV<5.00%)，精密度驗證合格。

2.4 特異度 該試劑盒與白色念珠菌、大腸埃希菌和解脲支原體不存在交叉反應(yīng)，與試劑盒說明書聲明一致，特異度驗證合格。

2.5 抗干擾能力 已知陽性標本分別加入干擾物(宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油)后，均檢出HPV16、31型，檢測結(jié)果及參考基因Ct值的CV為0.11%～0.32%，抗干擾能力驗證合格。

3 討 論

HPV DNA載量通常估計為每個細胞的HPV基因組拷貝數(shù)，與HPV感染疾病有很大程度的相關(guān)性，并且在區(qū)分正常細胞學和異常細胞學方面具有特異性[10]。目前，針對HPV的檢測方法主要有核酸分型定性檢測、HPV-原位雜交、雜交捕獲HPV DNA檢測、細胞學檢測、病理組織學檢測等，可用于檢測高危和低危的HPV亞型[11]。而現(xiàn)階段有些 HPV分型檢測試劑采用生物膜雜交法，該方法不僅操作步驟煩瑣，而且容易污染環(huán)境。雜交法試劑在檢測 HPV時，其靈敏度低于其他PCR擴增檢測試劑，存在一定比例的漏檢[12]。而采用多重熒光定量PCR，整個檢測過程自動化程度高、操作簡便，而且能最大限度避免擴增產(chǎn)物引起的環(huán)境污染，具有檢測原理簡單，易取材且取材量少，報告時效較短，以及收費合理等優(yōu)勢。因此，多重熒光定量PCR用于診斷HPV感染，對細胞異常人群的風險分層、促進患者管理有很重要意義[13]。

江蘇碩世生物科技股份有限公司的HPV試劑盒在儀器正常，以及空白對照、陽性對照、八聯(lián)管H孔FAM通道均正常的情況下，核酸擴增根據(jù)HPV亞型探針熒光標記進行分析。根據(jù)參考值(參考范圍)在8個樣本孔(A～H孔)中的HPV亞型擴增曲線呈典型S型曲線，且Ct值小于或等于參考值，判斷相應(yīng)的 HPV亞型為陽性；無典型S型擴增曲線或Ct值大于參考值，則判斷相應(yīng)的HPV亞型為陰性。準確度、最低檢測限、精密度和特異度驗證擴增曲線均有效，驗證結(jié)果為合格。在驗證抗干擾能力時，出現(xiàn)一條異常曲線，原因是該八聯(lián)管上機擴增前掌上離心機損壞，未離心的八聯(lián)管內(nèi)有氣泡，擴增時出現(xiàn)異常曲線，但其他擴增曲線沒有受到干擾，驗證結(jié)果合格是有效的。

該試劑盒以HPV基因組L1區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計21對各亞型特異性引物和21條特異探針，分別以FAM、HEX、ROX標記相應(yīng)亞型的探針。探針為包括5′端報告基團和3′端淬滅基團的寡核苷酸，在PCR擴增過程中，當探針完整時，由于淬滅基團靠近報告基團，報告基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收，不發(fā)出熒光信號。引物延伸時，與模板結(jié)合的探針被Taq酶(5′→3′外切核酸酶)切斷，報告基團與淬滅基團分離，產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號自動繪制出實時擴增曲線，從而實現(xiàn)對HPV在核酸水平上的定性檢測。多重熒光PCR技術(shù)與八聯(lián)管空間分隔技術(shù)相結(jié)合，在反應(yīng)中每個PCR反應(yīng)孔內(nèi)僅包含3對不同亞型的特異性引物及其相應(yīng)的3條分別以FAM、HEX、ROX熒光標記的特異探針，檢測3個通道即可分析出具體亞型，故HPV不同亞型之間不可能存在交叉反應(yīng)。 這種檢測原理的試劑盒通過多個反應(yīng)孔實現(xiàn)多種亞型的分型，特異性引物PCR 的優(yōu)勢在于能夠保證高靈敏度和高特異度地鑒定單一亞型，有利于在多重感染中檢出不同 HPV亞型。

此外，《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型試劑技術(shù)審查指導原則》[14]中提到干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括血紅蛋白、白細胞、宮頸黏液、陰道避孕藥物、女性衛(wèi)生用品、陰道用抗真菌藥物、陰道潤滑劑等。本次性能驗證選擇常規(guī)檢測標本中常見的干擾物包括宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油。在月經(jīng)期一般不建議做HPV核酸檢測，故本次試驗未選擇女性衛(wèi)生用品。陰道避孕藥物和陰道用抗真菌藥物一般需要在陰道環(huán)境中作用一段時間，使有效成分釋放，考慮到很難做到較真實的臨床模擬，故未選擇。

該試劑盒可一次性檢出21種HPV亞型，包括常見的18種高危型和3種低危型，涵蓋了常見的引起不良轉(zhuǎn)歸的亞型。檢測過程比較簡單、高效，同時也不能忽視其可能存在的問題。由于該試劑盒采用八聯(lián)管空間分隔技術(shù)，導致檢測通量相對較低。對于大批量篩查需要多臺實時熒光定量PCR儀。另外，PCR檢測技術(shù)也可能由于受DNA提取、樣品類型和檢測方法局限的影響，甚至存在攜帶污染、擴增產(chǎn)物污染等造成的假陽性、假陰性。在檢測過程中，若存在標本采樣、運輸、保存條件及實驗操作不當?shù)瓤蓪е聟⒖蓟驍U增曲線異常，則該次試驗定性結(jié)果為無效。嚴格按照試劑說明書及實驗室標準操作程序進行操作，可最大限度避免無效結(jié)果出現(xiàn)。

綜上所述，本研究整個性能驗證過程均處于有效的質(zhì)量控制下，做到最大限度保證數(shù)據(jù)的準確性及可重復(fù)性，性能驗證符合行業(yè)標準需求，這份HPV亞型檢測試劑盒(熒光定量PCR)可在本實驗室進行臨床檢驗相關(guān)診斷。