張 陽,梅 翠，李 會，熊 靜，王士源，程 鵬，喻 祥，何玉張，吳俊偉，陳紅偉,3* (.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460;2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460;3.國家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心，重慶 402460)

白術(shù)多糖(Atractylodesmacrocephalapolysaccharide，AMP)是白術(shù)的主要藥用成分，具有多種生物活性，如增加小鼠的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[1]，緩解免疫抑制[2]，改善腸道菌群紊亂等[3]。另外，因其具有改善動物腸道健康和提高免疫功能的作用，有開發(fā)為高效飼料添加劑的前景[4]。但是，由于天然多糖的免疫活性往往較低，可通過對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，增強(qiáng)其免疫活性，其中硒化修飾為常見的修飾方法[5]。由于硒和天然多糖的協(xié)同作用，其活性往往顯著高于硒或多糖[6]。值得注意的是，XU等[7]報道了在熱應(yīng)激條件下，硒和AMP在調(diào)節(jié)雞免疫功能中具有重要作用，并存在協(xié)同效應(yīng)，但該研究僅將硒與AMP聯(lián)合使用，未對AMP進(jìn)行硒化修飾。本研究采用HNO3-Na2SeO3法合成了硒化白術(shù)多糖(sAMP)，并以未修飾的AMP和亞硒酸鈉為對照，以環(huán)磷酰胺致免疫功能低下的小鼠為研究對象，考察了sAMP的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。在當(dāng)前全面禁用飼用抗生素的背景下，本研究旨在對植物飼料資源的合理開發(fā)利用并為開發(fā)新型高效飼料添加劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑白術(shù)，重慶市榮昌區(qū)中醫(yī)院；SOD和MDA試劑盒，南京建成生物有限公司；環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；印度墨汁，南京都萊生物技術(shù)有限公司；IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒，武漢博士德生物有限公司；胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；小牛血清，蘭州民海生物科技有限公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限公司；MTT，上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，美國Giboc公司；ConA液，上海源葉生物科技有限公司等。

1.2 主要儀器與設(shè)備DC-NSG-10多功能提取濃縮機(jī)組，上海達(dá)程實驗設(shè)備有限公司；YU-1950雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Nicolet iS50傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀，賽默飛世爾科技公司；Bio-Rad680伯樂酶標(biāo)儀，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司等。

1.3 實驗動物體質(zhì)量相近、健康的斷奶昆明種小鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，參考本課題組報道的方法進(jìn)行實驗動物的飼養(yǎng)管理[8]。

1.4 sAMP的制備與表征[9]以本課題組已制備保存的AMP為原料，AMP提取純化簡要流程如下[10]：將薄層色譜法鑒定合格的白術(shù)飲片采用水提醇沉淀法制備白術(shù)粗多糖，采用三氯乙酸進(jìn)行純化和柱層析洗脫，收集多糖溶液，冷凍干燥得到AMP，采用色譜法鑒別AMP，硫酸-苯酚法檢測AMP含量后保存?zhèn)溆谩⒖嘉墨I(xiàn)[9]，將1.0 g AMP粉置于三口燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.4% HNO3水溶液100 mL，加熱、攪拌使多糖全部溶解，水浴升溫至70℃時，分別加入0.8 g Na2SeO3和1.44 g BaCl2，反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液冷卻到室溫，用無水Na2CO3調(diào)反應(yīng)液pH至5～6，再加入適量無水Na2SO4沉淀未反應(yīng)完的BaCl2，離心去沉淀，透析，取透析液少量加入抗壞血酸檢測，無紅色時停止透析，冷凍干燥得sAMP。具體反應(yīng)條件通過正交試驗設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化。再分別取AMP和sAMP少量，采用溴化鉀壓片后進(jìn)行紅外光譜掃描表征。

1.5 動物試驗設(shè)計

1.5.1抗氧化作用觀察 將60只小鼠隨機(jī)分為5個組，即空白組(NS)、環(huán)磷酰胺組(CP)、亞硒酸鈉組(SS)、AMP組和sAMP組，每組12只，連續(xù)灌胃給藥14 d，在灌胃第2 天除NS組注射生理鹽水，其他各組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg)，連續(xù)注射5 d。正常對照組及環(huán)磷酰胺組給予等體積生理鹽水，所有試驗組均灌胃給藥0.1 mg/kg，連續(xù)灌胃14 d，第14天給藥后12 h，摘眼球采血，離心備用。取血完畢后，脫頸椎處死小鼠，迅速取肝臟，采用試劑盒檢測小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力，比較各組的SOD活力大小；用試劑盒測定小鼠肝組織中丙二醛(MDA)的含量，檢測各組對MDA含量的影響。

1.5.2免疫調(diào)節(jié)作用觀察 將170只小鼠隨機(jī)分為5組，分組和給藥同1.5.1。對免疫器官胸腺和脾臟測質(zhì)量，計算胸腺和脾臟指數(shù)；用碳粒廓清法比較各試驗組對小鼠碳粒廓清功能的影響；用試劑盒測定小鼠血清中溶菌酶的含量。采用ELISA法測定血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。采用MTT法測試小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性。

1.6 主要測定項目與方法[8]

1.6.1SOD活力和MDA含量檢測 將小鼠肝臟組織在4℃冰浴下用生理鹽水制成10%組織勻漿，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法，測定肝臟組織中SOD活力和MDA含量[11]。

1.6.2免疫器官指數(shù)的測定 取小鼠胸腺和脾臟，用濾紙吸干血跡后稱其質(zhì)量，以胸腺或脾臟質(zhì)量與小鼠體質(zhì)量的比值計算其器官指數(shù)(單位：mg/10 g)[8]。

1.6.3碳粒廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)測定 按0.01 mL/g于小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨水。注入墨水后2和8 min用特制取血吸管從小鼠眼眶后靜脈叢取血0.025 mL，立刻吹入0.1% Na2CO32.000 mL中，以0.025 mL正常小鼠血溶于2.000 mL 0.1% Na2CO3液校零，于分光光度計上675 nm處測定D值，計算碳粒廓清指數(shù)K和吞噬系數(shù)α，計算公式如下：碳粒廓清指數(shù)K=(lgD1-lgD2)/(t2-t1)；吞噬系數(shù)α=體質(zhì)量×K1/3/(肝臟質(zhì)量+脾臟質(zhì)量)[12]。

1.6.4小鼠血清中細(xì)胞因子和溶菌酶含量的檢測[8]按ELISA試劑盒說明書測定小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6以及溶菌酶的含量。

1.6.5淋巴細(xì)胞增殖試驗(MTT法) 參考課題組已報道的方法[8]，簡要流程如下：Hanks液反復(fù)沖洗脾臟，加入胰蛋白酶消化制成單個細(xì)胞懸液。取淋巴細(xì)胞分離液，加入脾臟細(xì)胞懸液，水平離心吸取中間白細(xì)胞層，加入1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，接種入96孔板，每個樣品重復(fù)8孔，同時加ConA液刺激，另設(shè)細(xì)胞調(diào)零孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，吸出上清液，加入裂解液，檢測570 nm下的吸光度，作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 紅外光譜檢測結(jié)果AMP和sAMP在4 000.00～400.00 cm-1范圍的紅外吸收光譜如圖1所示。與AMP光譜圖(圖1A)相比，sAMP光譜(圖1B)顯示出1個特征吸收帶，其中2個出現(xiàn)在661.82，780.83 cm-1處，表明Se-O-C鍵的伸縮振動[13-15]，另1個出現(xiàn)在1 057.52 cm-1處，表明O-Se-O鍵的伸縮振動[13-16]。另外，文獻(xiàn)報道亞硒酸鈉的SeO32-在786.90，737.30 cm-1處有特征吸收峰[17]，sAMP在780.83 cm-1處有1個特征吸收峰，推斷此峰為亞硒酸酯特征吸收峰，而sAMP經(jīng)過透析后檢測已無亞硒酸根，證明該特征峰是多糖與亞硒酸根形成的，多糖分子中存在亞硒酸基團(tuán)。綜上所述，表明AMP硒化修飾成功。

A. AMP的紅外光譜圖；B. sAMP的紅外光譜圖圖1 紅外吸收光譜圖

2.2 抗氧化試驗結(jié)果各組肝臟SOD活性和MDA含量如圖2所示。sAMP組的SOD水平顯著高于CP、NS和SS組(P<0.05)，SS和AMP組的SOD水平顯著高于CP組(P<0.05)，sAMP組最高(圖2A)。sAMP組的MDA水平顯著低于其他4組(P<0.05)，而SS和AMP組的MDA水平顯著低于CP組(P<0.05)(圖2B)。

注：同一字母表示無顯著性差異(P>0.05)，而不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。下同圖2 對小鼠肝臟中SOD(A)和MDA(B)含量的影響

2.3 免疫器官指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)測定結(jié)果各組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)如圖3所示。sAMP組的胸腺和脾臟指數(shù)以及碳粒廓清指數(shù)均顯著高于CP和NS組(P<0.05)(圖3A～C)，sAMP組的胸腺指數(shù)顯著高于AMP和SS組(P<0.05)(圖3A)，sAMP組的碳粒廓清指數(shù)顯著高于SS組(P<0.05)(圖3C)，sAMP組的吞噬系數(shù)顯著高于CP組(P<0.05)(圖3D)。

A.胸腺指數(shù)；B.脾臟指數(shù)；C.碳粒廓清指數(shù)；D.吞噬系數(shù)圖3 對小鼠免疫器官指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)的影響

2.4 小鼠血清中細(xì)胞因子和溶菌酶含量測定結(jié)果各組小鼠血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α和溶菌酶水平見圖4。sAMP組血清中IL-4水平最低，且顯著低于NS組(P<0.05)(圖4A)。sAMP組血清IL-6水平高于CP、NS和AMP組，但差異不顯著(P>0.05)，SS和CP組之間存在顯著性差異(P<0.05)(圖4B)。sAMP組血清IFN-γ水平最高，且顯著高于其余4個組(P<0.05)，CP組的IFN-γ水平最低，顯著低于NS、AMP和sAMP組(P<0.05)(圖4C)。sAMP組血清TNF-α水平最低，顯著低于NS組(P<0.05)(圖4D)。sAMP組的血清溶菌酶水平最高，顯著高于其余4個組(P<0.05)，CP組的血清溶菌酶水平最低，顯著低于其余4個組(P<0.05)(圖4E)。然而，AMP和NS組之間的IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α和溶菌酶水平均沒有呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A.IL-4；B.IL-6；C.IFN-γ；D.TNF-α；E.溶菌酶圖4 對小鼠血清中細(xì)胞因子和溶菌酶的影響

2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測定結(jié)果通過ELISA測量570 nm處的吸光度作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。如圖5所示，sAMP組的D值顯著高于NS和CP組(P<0.05)，但其他組間差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

3 討論

HNO3-Na2SeO3法具有工藝簡單、修飾產(chǎn)物硒含量高、污染少、生物利用度高、可行性強(qiáng)等諸多優(yōu)點，是目前多糖硒化改性最常用的方法之一[18]。通常，硒化多糖的硒含量(102～104μg/g)遠(yuǎn)高于天然含硒多糖(<50 μg/g)[19]。本研究中，HNO3-Na2SeO3法的最佳反應(yīng)條件為硝酸0.4%，反應(yīng)時間10 h，反應(yīng)溫度70℃。在此條件下，sAMP的硒含量為(7.12±0.25) mg/g。隨后，本課題組評估了硒化AMP的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。

SOD是體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，對機(jī)體的促氧化和抗氧化系統(tǒng)起到平衡作用，可保護(hù)細(xì)胞免受損傷，通常血清中SOD含量代表細(xì)胞的抗氧化能力[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，MDA水平升高反映脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)和組織損傷[20]。SHULEI等[21]報道了硒化枸杞多糖能顯著提高14日齡雞的血清SOD活性和降低MDA含量，且效果明顯優(yōu)于未修飾枸杞多糖。YUE等[16]采用HNO3-Na2SeO3法硒化修飾了五味子多糖，修飾產(chǎn)物也能顯著提高14日齡雞的血清SOD活性和降低MDA含量，且效果明顯優(yōu)于未修飾多糖。本研究結(jié)果顯示，sAMP能顯著提高環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，且效果優(yōu)于未修飾的AMP和亞硒酸鈉，表明sAMP比AMP和無機(jī)硒具有更好的抗氧化活性。宿主免疫反應(yīng)包括先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，并依賴于重要的免疫器官，如胸腺、脾臟等，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型可用于評估多糖的免疫調(diào)節(jié)活性[22]。WENNA等[22]報道了白藜蘆醇粗多糖可緩解環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫器官萎縮和體質(zhì)量減輕，并增加脾臟和胸腺的指數(shù)，對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)作用。另外，紅棗多糖、太子參多糖及其硒化產(chǎn)物、黃芪多糖和淫羊藿多糖等均可顯著增加小鼠免疫器官指數(shù)[5,23-24]。本研究結(jié)果顯示，sAMP組的胸腺、脾臟指數(shù)和碳粒廓清指數(shù)均顯著高于NS和CP組，表明sAMP可促進(jìn)和恢復(fù)小鼠免疫器官胸腺和脾臟的生長發(fā)育，提高小鼠的免疫清除功能。

溶菌酶是裂解革蘭陽性菌的常用酶，主要由單核巨噬細(xì)胞釋放，可以作為吞噬系統(tǒng)功能的指標(biāo)，主要參與非特異性免疫反應(yīng)[25]。而細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，分為Th1和Th2細(xì)胞，是機(jī)體免疫反應(yīng)的一項主要指標(biāo)[8]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞通常分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)體液免疫[26-27]。近年來，有大量文獻(xiàn)報道多糖對實驗動物細(xì)胞因子水平或溶菌酶的影響，如黃芪和淫羊藿多糖硫酸酯混合物可明顯提高小鼠血清中的溶菌酶含量[24]；紅棗多糖可增強(qiáng)小鼠腸道溶菌酶和酸性磷酸酯酶的活性，下調(diào)腸道IL-1β等蛋白表達(dá)[23]；太子參多糖和硒化修飾產(chǎn)物均可以增加免疫抑制小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌[5]；白藜蘆醇粗多糖可刺激免疫抑制小鼠血清和脾臟中TNF-α、IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生[22]；枸杞多糖有效促進(jìn)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的分泌[28]；黨參多糖可降低結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α水平，提高結(jié)腸組織中IL-10水平[29]；黑木耳胞外多糖可提升血清中細(xì)胞因子IL-10的含量，對TNF-α和IL-6的水平無顯著性影響[30]。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞亞群借助其分泌的細(xì)胞因子形成負(fù)反饋，相互制約，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡[8]。在本研究中，sAMP顯著增加了免疫抑制小鼠血清中溶菌酶和IFN-γ的水平，降低了IL-4和TNF-α水平，且效果優(yōu)于未修飾的AMP。初步表明，sAMP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生γ干擾素，同時通過調(diào)節(jié)Th1/Th2處于一個相對平衡的狀態(tài)，緩解環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下水平。

淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱，通常代表了淋巴細(xì)胞功能的高低，檢測淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究的一種常用方法[8]。裴鈺等[31]報道了瓦松粗多糖可提高B、T淋巴細(xì)胞增殖率；靈芝多糖可提高小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力[32]；苦瓜多糖、白芷多糖可促進(jìn)環(huán)磷酰胺所致免疫低下模型小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，sAMP組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(D570 nm)顯著高于NS和CP組，增殖效果優(yōu)于未修飾的AMP。

綜上所述，sAMP能顯著提高小鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，顯示出比未修飾的AMP和無機(jī)硒具有更好的抗氧化活性。sAMP可促進(jìn)和恢復(fù)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫器官胸腺和脾臟的生長發(fā)育，提高小鼠的免疫清除功能，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生γ干擾素和溶菌酶，提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性，緩解環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下水平，總體效果優(yōu)于未修飾的AMP。