王鈺蕊，熊曾恒，李春芳，鐘 悅

(海南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，海南 ?？?571126)

1 引言

在天然水和廢水中，磷幾乎都以各種磷酸鹽的形式存在，它們分為正磷酸鹽，縮合磷酸鹽(焦磷酸鹽、偏磷酸鹽和多磷酸鹽)和有機(jī)結(jié)合的磷(如磷脂等)，其廣泛存在于溶液中，腐殖質(zhì)粒子中或水生生物中[1]。但水體中磷含量過(guò)高易導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，引發(fā)藻類大量繁殖，并產(chǎn)生一種能對(duì)水生生物和人體健康有毒害作用的藻毒素[2]。所以水中磷含量是水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[3]。2000年，中國(guó)七大重點(diǎn)流域地表水劣Ⅴ類占13.8%，主要淡水湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題突出，總氮、總磷及高錳酸鹽指數(shù)為主要污染指標(biāo)[4]。至2010年，全國(guó)地表水污染持續(xù)加重，劣Ⅴ類上升至16.4%，26個(gè)國(guó)控重點(diǎn)湖泊中劣Ⅴ類達(dá)38.5%，總氮、總磷為主要污染指標(biāo)[5]。截至2020年12月份，國(guó)內(nèi)主要流域、湖泊及水庫(kù)的水生生態(tài)系統(tǒng)得到有效恢復(fù)，1940個(gè)水質(zhì)斷面中劣Ⅴ類斷面降至1.0%，主要污染指標(biāo)為化學(xué)需氧量、高錳酸鹽指數(shù)和總磷[6]。過(guò)量氮和磷等面源污染物進(jìn)入地表水體，嚴(yán)重威脅我國(guó)水環(huán)境安全[7]，使不可再生的資源變成了破壞環(huán)境的主要污染指標(biāo)。

目前針對(duì)水體中總磷的測(cè)定，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法[8]和流動(dòng)注射測(cè)定法[9]，其原理均是將試樣中各種形態(tài)的磷通過(guò)消解轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，在銻鹽的催化下正磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸雜多酸，進(jìn)而在酸性介質(zhì)中被還原為較穩(wěn)定的藍(lán)色絡(luò)合物，依據(jù)朗伯比爾定律測(cè)定其含量[10]。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行手工測(cè)定水中總磷含量時(shí)，高壓蒸汽滅菌鍋消解的加熱時(shí)間和冷卻時(shí)間共計(jì)約3 h[11]，整個(gè)分析過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)。相比之下，流動(dòng)注射法總磷樣品分析頻率為1 h 30樣，樣品分析速度快。流動(dòng)注射法是一種新型的流動(dòng)分析技術(shù)，流動(dòng)注射分析儀具有快速、靈敏、高效等特點(diǎn)[12]。

本文使用北京寶德儀器有限公司生產(chǎn)的BDFIA-8000型全自動(dòng)流動(dòng)注射分析儀進(jìn)行水中總磷的測(cè)定。BDFIA-8000型全自動(dòng)流動(dòng)注射分析儀的工作原理是通過(guò)封閉的管路連接樣品和氧化劑、還原劑、顯色劑和消解液等試劑，試樣與試劑在蠕動(dòng)泵的推動(dòng)下進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)模塊，將一定體積的樣品注射到一個(gè)流動(dòng)的、無(wú)空氣間隔的連續(xù)載流中，樣品與試劑在分析模塊中按選定的順序和比例混合、反應(yīng)，在非完全反應(yīng)的條件下，進(jìn)入流動(dòng)檢測(cè)池于波長(zhǎng)880 nm處進(jìn)行光度檢測(cè)，通過(guò)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器和軟件實(shí)現(xiàn)測(cè)量和數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化定量測(cè)定樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量，詳見(jiàn)圖1[13]。

圖1 流動(dòng)注射法測(cè)定總磷流程

新時(shí)代，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)從環(huán)境管理領(lǐng)域，上升為國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分，成為國(guó)家生態(tài)文明建設(shè)的重要支撐。生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)、準(zhǔn)確、完整，成為政府改善環(huán)境民生的重要內(nèi)容。提升生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)的現(xiàn)代化水平成為必然趨勢(shì)。流動(dòng)分析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化、樣品通量高、重復(fù)性好、試劑和樣品消耗低以及封閉分析管道污染少等優(yōu)點(diǎn)[14]。本文選取高中低3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品和一個(gè)地表水實(shí)際樣品，分別采用手工測(cè)定法(GB 11893-89)和流動(dòng)注射法(HJ 671-2013)進(jìn)行總磷含量的測(cè)定，通過(guò)參照環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則[15]中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行方法比對(duì)研究，對(duì)比兩種方法的檢出限、精密度、準(zhǔn)確度和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果，尋找提高檢測(cè)效率、適用于大批量樣品的分析方法，提升生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)的現(xiàn)代化水平，以應(yīng)對(duì)日益強(qiáng)化的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

2.1.1 儀器

BDFIA-8000型全自動(dòng)流動(dòng)注射分析儀(北京寶德儀器有限公司)：包括自動(dòng)進(jìn)樣器、分析模塊、檢測(cè)模塊、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器有限公司)；滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；分析天平(梅特勒托利多國(guó)際有限公司)：精度0.1 mg；超聲波清洗器(上海聲松實(shí)業(yè)有限公司)：頻率40 kHz；真空泵(予華儀器有限責(zé)任公司)：轉(zhuǎn)速2800 r/min。

2.1.2 試劑

總磷標(biāo)準(zhǔn)樣品203979[(0.804±0.029)mg/L]、203988[(0.496±0.020)mg/L]和203985[(0.270±0.016)mg/L]，均來(lái)自于生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所。水質(zhì)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW(E)080368(500mg/L)，來(lái)自于水利部水環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)研究中心。

所用試劑有過(guò)硫酸鉀、抗壞血酸、鉬酸鹽、酒石酸銻鉀和硫酸，以上試劑均為AR級(jí)。流動(dòng)注射分析法顯色劑使用北京寶德儀器有限公司生產(chǎn)的專用試劑包。實(shí)驗(yàn)使用的水為新鮮制備的去離子水。流動(dòng)注射法配制好的試劑需使用超聲波清洗機(jī)和真空泵脫氣30 min。

2.1.2.1 流動(dòng)注射法試劑的配置

過(guò)硫酸鉀溶液(氧化劑):稱取26 g過(guò)硫酸鉀溶于700 mL去離子水中，溶解后用去離子水稀釋至1 L并混勻。

抗壞血酸溶液(還原劑)：稱取70.0 g抗壞血酸溶于700 mL去離子水中，溶解后用去離子水稀釋至1 L并混勻。

鉬酸鹽混合溶液(顯色劑)：流動(dòng)注射分析儀專用試劑包，試劑瓶中先加入450 mL去離子水，緩慢加入試劑包2，充分溶解并冷卻后，再加入試劑包1，溶解后用去離子水定容至500 mL并混勻。

10%硫酸(消解液)：量取103 mL硫酸，緩慢加入至約800 mL去離子水中，期間用玻璃棒攪拌，待冷卻后用去離子水定容至1 L并混勻。

2.1.2.2 手工測(cè)定法試劑的配置

過(guò)硫酸鉀溶液(氧化劑)：稱取5 g過(guò)硫酸鉀溶于80 mL去離子水中，溶解后用去離子水稀釋至100 mL并混勻。

10%抗壞血酸溶液(還原劑)：稱取10.0 g抗壞血酸溶于80 mL去離子水中，溶解后用去離子水稀釋至100 mL并混勻。

鉬酸鹽溶液(顯色劑)：稱取13 g鉬酸鹽溶于100 mL去離子水中，稱取0.35 g酒石酸銻鉀溶于100 mL去離子水，在不斷攪拌下把鉬酸鹽溶液緩緩加到300 mL(1+1)硫酸中，冷卻后加酒石酸銻鉀溶液并且混合均勻。

2.2 分析步驟

2.2.1 流動(dòng)注射法分析步驟

使用BDFIA-8000型全自動(dòng)流動(dòng)注射分析儀，按要求將各溶液管路接好后運(yùn)行，待基線穩(wěn)定后，取10 mL試樣于進(jìn)樣管中，進(jìn)行空白和樣品的測(cè)定。該儀器方法主要程序參數(shù)為：加熱溫度125 ℃；洗針時(shí)間60 s；進(jìn)樣時(shí)間40 s；出峰時(shí)間140 s；進(jìn)載流時(shí)間60 s；峰寬100 s；注射時(shí)間50 s；到達(dá)閥時(shí)間50 s；樣品周期時(shí)間130 s；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速35 r/min。

2.2.2 手工測(cè)定法分析步驟

向試樣中加4 mL過(guò)硫酸鉀溶液，將比色管的蓋子蓋緊后，用一小塊布和線將玻璃塞扎緊，置于高壓滅菌鍋中加熱，待壓力達(dá)到1.1 kg/cm2，相應(yīng)溫度為120 ℃時(shí)，保持30 min后停止加熱。待壓力表讀數(shù)降至零后，取出放冷。然后用水稀釋至刻度線。分別向各份消解液中加入1 mL抗壞血酸溶液混勻，30 s后加2 mL鉬酸鹽溶液充分混勻。室溫下放置15 min后取上清液，使用光程為30 mm比色皿，在700 nm波長(zhǎng)下，以水作參比，測(cè)定吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 校準(zhǔn)曲線的測(cè)定

在250.00 mL容量瓶中加入5.00 mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW(E)080368，用水稀釋至標(biāo)線，配制成濃度為10.00 mg/L的總磷標(biāo)液中間液。在100.00 mL容量瓶中加入20.00 mL總磷標(biāo)液中間液，用水稀釋至標(biāo)線，配制成濃度為2.00 mg/L的總磷標(biāo)液使用液。

3.1.1 手工測(cè)定法工作曲線

取7支50 mL比色管分別加入0 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、12.0 mL總磷標(biāo)液使用液(濃度為2.00 mg/L)，加水至25 mL。按分析步驟測(cè)定并繪制工作曲線，詳見(jiàn)圖2。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列的分析，得出總磷在0.00～0.48 mg/L范圍內(nèi)線性良好，手工測(cè)定法工作曲線：y=0.0304x+0.0017，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

圖2 分光光度法法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 流動(dòng)注射法工作曲線

在7支100 mL容量瓶中分別加入0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、20.00 mL總磷標(biāo)液中間液(濃度為10.00 mg/L)，加水至100 mL。按分析步驟，由進(jìn)樣器從低濃度到高濃度依次進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定信號(hào)值峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的磷濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，詳見(jiàn)圖3。分析得出總磷在0.000～2.000 mg/L范圍內(nèi)線性良好，流動(dòng)注射法工作曲線：y=0.0015x+0.0035，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

圖3 流動(dòng)注射法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 方法檢出限

參照HJ 168-2020環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則中規(guī)定，取7個(gè)空白試樣使用以上兩種分析方法，按照樣品的分析步驟進(jìn)行總磷的測(cè)定，計(jì)算該兩種方法中7個(gè)平行樣測(cè)定結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，方法檢出限=標(biāo)準(zhǔn)偏差×t(n-1)(t(6)=3.143)，以4倍檢出限作為測(cè)定下限，詳見(jiàn)表1。手工測(cè)定法總磷的檢出限為0.009 mg/L，測(cè)定下限為0.036 mg/L；流動(dòng)注射法總磷的檢出限為0.003 mg/L，測(cè)定下限為0.012 mg/L。這兩種方法的檢出限分別低于手工法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 11893-89的檢出限0.01 mg/L和流動(dòng)注射法國(guó)家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)HJ 671-2013的檢出限0.005 mg/L。

表1 檢出限測(cè)定結(jié)果

3.3 精密度和準(zhǔn)確度

按照HJ 168-2020的相關(guān)規(guī)定，對(duì)地表水實(shí)際樣品采集6個(gè)總磷濃度水平接近的樣品進(jìn)行加標(biāo)，分別采用這2種方法測(cè)定加標(biāo)回收率，詳見(jiàn)表2。手工法測(cè)定總磷加標(biāo)樣品的回收率為98.5%。流動(dòng)注射法測(cè)定總磷加標(biāo)樣品的回收率為102.5%。這2種方法的加標(biāo)回收率均滿足水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法中總磷濃度大于0.025 mg/L時(shí)，加標(biāo)回收率在90%～110%范圍內(nèi)的要求。

表2 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

選擇3種不同濃度的生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所的總磷標(biāo)準(zhǔn)樣品203979[(0.804±0.029)mg/L]、203988[(0.496±0.020)mg/L]和203985[(0.270±0.016)mg/L]分別使用這2種方法重復(fù)測(cè)定6次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)和相對(duì)誤差RE(%)，詳見(jiàn)表3。手工法測(cè)定總磷高濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.75%、RSD為1.21%；測(cè)定總磷中濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.81%、RSD為1.50%；測(cè)定總磷低濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.37%、RSD為1.85%。流動(dòng)注射法測(cè)定總磷高濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.12%、RSD為1.24%；測(cè)定總磷中濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.60%、RSD為1.32%；測(cè)定總磷低濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的RE為0.37%、RSD為1.51%。高中低3種不同濃度的總磷標(biāo)準(zhǔn)樣品分別使用兩種方法的測(cè)定結(jié)果均在各自的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，RE均小于1%，RSD均小于2%。這2種分析方法測(cè)定水中總磷含量的準(zhǔn)確度和精確度良好。

表3 精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

3.4 顯著性差異分析

根據(jù)HJ 168-2020對(duì)兩種檢驗(yàn)方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析，對(duì)地表水實(shí)際樣品采集7個(gè)總磷濃度水平接近的樣品，分別采用這兩種方法進(jìn)行測(cè)定獲得7組配對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)。對(duì)這兩種方法均分別進(jìn)行平行雙樣測(cè)定，平行雙樣測(cè)定的平均值分別記做測(cè)定值(A)和測(cè)定值(B)，獲得該總磷濃度樣品的測(cè)定結(jié)果配對(duì)差值(d=A-B)，詳見(jiàn)表4。

表4 實(shí)際樣品總磷測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

在地表水的總磷測(cè)定中，手工法在0.00～0.48 mg/L范圍具有良好的線性關(guān)系(r≥0.9998)，同時(shí)流動(dòng)注射法在0.000～2.000 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r≥0.9999)。手工測(cè)定法總磷的檢出限為0.009 mg/L，流動(dòng)注射法總磷的檢出限為0.003 mg/L。這兩種分析方法的檢出限均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢出限，但與手工法檢出限相比，流動(dòng)注射法的檢出限更低，相對(duì)提高了總磷檢出的靈敏性。手工法與流動(dòng)注射法沒(méi)有顯著性差異，重復(fù)性較好。手工法測(cè)定總磷加標(biāo)樣品的回收率為98.5%。流動(dòng)注射法測(cè)定總磷加標(biāo)樣品的回收率為102.5%。這2種方法的加標(biāo)回收率均滿足要求。高中低3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品使用流動(dòng)注射法和手工法的測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，RE均小于1%，RSD均小于2%，這2種分析方法的準(zhǔn)確度和精確度良好，都能為防治和保護(hù)環(huán)境污染政策提供有效、真實(shí)的數(shù)據(jù)。但是與經(jīng)典的國(guó)標(biāo)法相比，流動(dòng)注射法具有檢測(cè)效率高、檢測(cè)線性范圍更寬、靈敏度更高、可檢測(cè)樣品的濃度范圍更廣等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)使用試劑量少，減少了檢測(cè)廢液，是一種更為環(huán)保、高效的分析方法，在進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。