樊云芳 劉露露 張晶 羅青 張波 曹有龍

摘要：研究旨在探索適合枸杞的潮霉素篩選劑量，為枸杞基因功能的研究、遺傳轉化提供參考。以寧夏枸杞無菌苗葉片為外植體，設置4個潮霉素濃度梯度，研究其對誘導愈傷組織和愈傷組織誘導分化芽的影響，以選出適合枸杞轉化體篩選的抗生素劑量。結果表明，隨著潮霉素濃度的升高，其對枸杞誘導愈傷組織和愈傷組織誘導芽分化的抑制作用加強。潮霉素濃度越高，枸杞葉片的出愈率越低，愈傷組織的褐化率越高，且葉片逐漸變黃、白化甚至死亡。將潮霉素作為抗性選擇標記時，抗性濃度以2 mg/L為最佳。

關鍵詞：寧夏枸杞；潮霉素；抗性濃度；選擇標記；遺傳轉化

中圖分類號：Q789文獻標志碼：A論文編號：cjas2020-0017

Screening on Hygromycin Resistance Concentration of Lycium barbarum

FAN Yunfang1， LIU Lulu2， ZHANG Jing1， LUO Qing1， ZHANG Bo1， CAO Youlong1

（1Lycium Engineering Technology Research Center， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750002， Ningxia， China；2Natural Resources Bureau of Longde County， Guyuan 756300， Ningxia， China）

Abstract： This study aims to explore the screening dose of hygromycin suitable for Lycium barbarum， and lay a foundation for the study of gene function and genetic transformation of L. barbarum. In this study， the leaves of germless L. barbarum seedlings from Ningxia were used as explants， and four hygromycin concentration gradients were set to study the effect of hygromycin on the induction of callus and callus differentiation buds， to screen out the appropriate antibiotic dose for L. barbarum transformation body screening. The results showed that the increased concentration of hygromycin had a significant inhibitory effect on the induced callus and bud differentiation of L. barbarum. The higher the concentration of hygromycin， the lower the recovering rate of L. barbarum leaves was， and the browning rate of callus increased， and the leaves gradually became yellow， albino， and even died. Using hygromycin as a selective marker for resistance， the optimal concentration of hygromycin is 2 mg/L.

Keywords： Lycium barbarum； hygromycin； resistance concentration； selected marker； genetic transformation

0引言

寧夏枸杞（Lycium barbarum）屬茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生落葉灌木，是寧夏的特色植物資源，為寧夏“五寶”之首。與其他物種相比，枸杞的遺傳轉化研究起步較晚，到目前為止雖然取得了一定的進展[1-5]但仍然落后于其他物種。對潮霉素的篩選劑量未見報道。

在植物基因工程研究中，快速、有效地從大量轉化體中篩選出含有外源目的基因的轉化體是成功獲得轉基因植株的關鍵[6]。為篩選出陽性轉化體植株，需要用到抗生素篩選、除草劑篩選和β-葡萄苷酸酶（GUS）染色反應篩選等諸多篩選方法，其中抗生素篩選是較為常見的方法之一。潮霉素（Hygromycin B，HygB）是一種常用的抗性篩選藥物，其抗性基因（潮霉素磷酸轉移酶基因htp）表達產物是一個蛋白激酶，通過磷酸化潮霉素B使其喪失活性[7]。遺傳轉化中轉化細胞具備了潮霉素磷酸轉移酶活性，能忍耐較高濃度潮霉素的毒性，轉化細胞的生長和分化受影響較小，葉綠體和線粒體蛋白質呈正常的綠色，而非轉基因植株由于缺乏潮霉素磷酸轉移酶基因，表現(xiàn)為植株綠色器官黃化或死亡，因此潮霉素可以明顯區(qū)分轉化組織與未轉化組織[8-9]。由于潮霉素Hyg在真原核生物中擁有較好的重復性和較短的篩選時間等優(yōu)點，所以被廣泛地應用在植物研究中[10-17]。筆者對潮霉素的不同濃度篩選效果進行研究，以期為基因的功能研究、潮霉素在枸杞遺傳轉化中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗時間、地點

試驗于2019年4—12月在寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所組織培養(yǎng)實驗室進行。

1.2試驗材料

枸杞種子采摘于寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所資源圃。

MS培養(yǎng)基粉、瓊脂粉、蔗糖、6-BA（芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、AS（乙酰丁香酮）、利福平、硫酸卡那霉素（Kan）、LB固體培養(yǎng)基（干粉）、LB液體培養(yǎng)基（干粉）、羧芐青霉素二鈉鹽（carb）、潮霉素（hyg）、DMSO。所用試劑均為分析純級別，其中MS培養(yǎng)基粉采購于青島日水生物技術有限公司，蔗糖采購于國藥集團化學試劑有限公司，其余均采購于索萊寶生物科技有限公司。

枸杞共培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA1mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+AS 2 mg/L；枸杞愈傷培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L+hyg+carb 500 mg/L；枸杞分化培養(yǎng)基為MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+6-BA0.4mg/L+NAA0.02mg/L+ hyg+carb 500 mg/L；枸杞生根培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L+NAA0.04 mg/L+hyg+carb 500 mg/L。

1.3主要儀器

超凈工作臺（型號SW-C5-2F，輸出功率300 W）、D-1型自動蒸汽滅菌鍋、紫外燈、離心機、pH計、風光光度計、人工氣候箱、電子天平、4℃冰箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、50 mL無菌離心管、150 mL無菌三角瓶、無菌濾紙、無菌培養(yǎng)皿、鑷子、手術刀。

1.4試驗方法

1.4.1無菌苗的培養(yǎng)用NaClO：H2O體積比1：3的溶液浸泡枸杞種子，在搖床輕搖40 min，取出用無菌水沖洗3遍，濾出種子，用濾紙吸干，在超凈工作臺中播種于MS培養(yǎng)基上，于25℃、光照16 h/天、光照強度2000 lx培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21天獲得枸杞種子苗，葉片用于后續(xù)侵染再生體系。

1.4.2潮霉素對葉片愈傷組織形成的敏感性試驗在苗齡為20天左右的生根試管苗上選取平展的葉片，切去葉柄和葉邊緣，切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，將切好的葉片用鑷子放入MS培養(yǎng)基活化的農桿菌菌液（OD600= 0.5）浸染10 min后，接種到共培養(yǎng)基上，進行暗培養(yǎng)3天。

將共培養(yǎng)3天的葉片分別轉到不同潮霉素濃度的培養(yǎng)基上，潮霉素濃度分別設為2、4、6、8 mg/L 4個梯度，每個梯度設置3個重復處理，每個培養(yǎng)皿接種15個葉片，葉片背面朝下，在25℃、12 h/12 h、光照度1500～ 2000 lx的條件下培養(yǎng)。接種后連續(xù)觀察，觀察葉片愈傷組織誘導的狀況以及葉片的生長情況，統(tǒng)計葉片誘導出愈傷組織的個數(shù)和葉片死亡的個數(shù)，計算出愈率、存活率、污染率和褐化率以及玻璃化的情況，如式（1）～（4）。

1.4.3潮霉素對愈傷組織誘導分化的敏感性試驗將誘導的愈傷組織接種到設有不同潮霉素濃度的分化培養(yǎng)基上。共設置2、4、6、8 mg/L 4種處理，每組接種5瓶，每瓶接種2個愈傷組織。接種后觀察并統(tǒng)計各處理組愈傷組織誘導芽分化的情況，觀察并記錄其分化芽的葉色、生芽數(shù)、芽色、芽長勢。

2結果與分析

2.1不同潮霉素濃度對枸杞愈傷組織誘導的影響

由表1可知，當潮霉素濃度為2 mg/L時，枸杞愈傷組織出愈率、成活率最高，褐化率最低，無污染和玻璃化現(xiàn)象；當潮霉素濃度為8 mg/L時，出愈率、成活率最低，褐化率最高，無污染和玻璃化現(xiàn)象。

由圖1可知，當潮霉素的濃度為2 mg/L時，枸杞葉片愈傷組織生長較多，且誘導所產生的愈傷組織為綠色并有綠色的生長芽點；當潮霉素的濃度升至4 mg/L時，枸杞葉片出愈率降低，誘導產生的愈傷組織顏色呈淺綠色，葉片部分變黃，出現(xiàn)褐化；當潮霉素的濃度升至6 mg/L時，枸杞葉片愈傷組織明顯減少，出愈率開始大幅降低，葉片已大部分出現(xiàn)白化死亡；當潮霉素的濃度升至8 mg/L時，枸杞葉片愈傷組織基本沒有，葉片呈淡綠色，大部分出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。

從以上結果可以得出，不同濃度潮霉素對枸杞愈傷組織有一定影響，對枸杞葉片誘導愈傷組織有明顯的抑制作用。隨著潮霉素濃度的提高，出愈率降低，枸杞葉片逐漸變黃，褐化，甚至死亡。枸杞葉片誘導愈傷組織的潮霉素抗性篩選濃度以2 mg/L為最佳。

2.2不同潮霉素濃度對枸杞愈傷組織誘導芽分化的影響

由表2可知，枸杞葉片愈傷組織誘導芽分化，當潮霉素濃度為2 mg/L時，其葉色呈現(xiàn)黃綠色，生芽數(shù)較多，生芽率為20%，芽色為淺綠色，芽長勢弱；當潮霉素濃度為4 mg/L時，其葉色呈現(xiàn)淡黃色，生芽數(shù)較少，生芽率為2%，芽色為白色芽點，芽長勢基本不生長；當潮霉素濃度為≥6 mg/L時，其葉色多白化，變黃，直到死亡。

由圖2可知，當潮霉素的濃度為2 mg/L時，枸杞葉片愈傷組織誘導的分化芽較多，其芽色和葉色都較正常；當潮霉素的濃度升至4 mg/L時，枸杞葉片愈傷組織誘導的分化芽較少，且芽色呈淺綠色有輕微變紫現(xiàn)象。

可以看出，潮霉素對枸杞葉片愈傷組織誘導芽分化起抑制作用。隨著潮霉素濃度的升高，枸杞葉片愈傷組織誘導芽分化率降低。在將潮霉素作為抗性選擇標記時，枸杞葉片直接誘導芽分化再生苗的潮霉素篩選濃度為2 mg/L。

3結論與討論

潮霉素經常被用做遺傳轉化體系中的抗生素篩選劑，在許多單子葉植物（如水稻[18]、大麥[19]、棉花[20]、玉米[21]、谷子[22]等）的科研試驗中得到廣泛的應用，同時也應用于雙子葉植物在基因轉化過程中，比如黑杉、針葉類、花生、菊花、黑刺槐、大豆、黃梁木等[23]。王哲等[24]用潮霉素作為煙草遺傳轉化篩選劑時使用濃度為5～ 20 mg/L。任永霞等[25]在番茄和菊花的遺傳轉化時使用潮霉素，濃度分別15、15～20 mg/L。王丹等[1]研究將潮霉素作為楊樹遺傳轉化篩選劑，以山新楊、歐美楊和小黑楊的葉片為材料，山新楊、歐美楊進行分化的潮霉素適宜濃度為2.0 mg/L，小黑楊為3.0 mg/L；當以楊樹的不定芽作為研究材料，生長和生根時山新楊和小黑楊的敏感濃度為2.0 mg/L，歐美楊為1.0 mg/L；當以莖段為材料，其生長和生根時山新楊和小黑楊的敏感性為6.0 mg/L，歐美楊2.0 mg/L。本試驗中確定枸杞無菌苗葉片誘導愈傷組織和愈傷組織誘導芽分化對潮霉素抗性標記較合適的篩選濃度為2 mg/L。上述所得結論說明，不同的材料對潮霉素產生影響的濃度不同，對同一材料的不同部位產生的敏感性也不同。應用農桿菌介導植物，在轉化之前應對不同的外植體進行選擇壓力篩選，找出既能有效抑制非轉化細胞生長又對轉化細胞影響較小的篩選劑敏感濃度，既能降低假陽性又能減少轉化苗的損失，獲得較高的轉化效率[2-3]。

由本試驗結果可以看出，枸杞遺傳轉化過程，潮霉素作為篩選劑時所用的劑量要比其他抗生素低很多，本研究枸杞潮霉素的選擇劑量為2 mg/L，而卡那霉素選擇劑量為50 mg/L[4]。說明潮霉素對植物細胞的傷害要遠大于卡那霉素，植物對其更敏感。愈傷組織誘導芽分化時，劑量4 mg/L時芽幾乎不生長，2 mg/L時芽長勢比較弱，說明后期誘導芽分化時，潮霉素的劑量可能需要更小一些。在敏感性篩選試驗中，濃度跨度設置要小一些，這樣可能更準確。

另外，為了提高轉化率，所選用的外植體都較幼嫩，抗性較弱，而潮霉素對植物的毒性很強，所以在加入篩選劑潮霉素時，加入的質量濃度要稍低于篩選出的選擇壓力，避免造成抗性芽的死亡。轉化過程中選擇劑加入的時間也很關鍵，選擇壓力（即篩選劑）加得太遲或太少，可能會使非轉化細胞分裂分化，致使假轉化體的比例增高，給轉基因工作（如轉基因植株或組織的鑒定）增加額外的工作[26]。

參考文獻

[1]薛定磊.枸杞遺傳轉化體系建立及FT轉基因植株的獲得[D].北京：中國科學院大學，2015：4-7.

[2]曲玲，曹有龍，羅青，等.轉基因枸杞研究中的問題探究[J].寧夏農學院學報，2001，22（2）：25-27.

[3]馬俊，吳祖河，唐勁天.寧夏枸杞的轉基因研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2013，41（10）：4262-4263.

[4]羅青，曲玲，曹有龍，等.抗蚜蟲轉基因枸杞的初步研究[J].寧夏農林科技，2001（1）：1-3.

[5]朱永興，曹鵬，許興，等.多基因表達載體KCTB轉化寧夏枸杞的研究[J].中國農學通報，2010，26（9）：74-77.

[6]王丹，鄒莉，王義，等.楊樹對潮霉素的敏感性研究[J].吉林農業(yè)大學學報，2010，32（1）：47-50.

[7]OLHOFT P M， FLAGEL L E， DONOVAN C M， et al. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method[J]. Planta，2003，5：723-735

[8]王堅，李永玲，劉煒.潮霉素B在遺傳轉化中應用的研究進展[J].寧夏農林科技，2017，58（12）：36-43.

[9]李東杰.植物生長調節(jié)劑對黑果枸杞愈傷組織誘導、增殖及分化的影響[J].河北林業(yè)科技，2016（4）：1-5.

[10]蔡瑩.農桿菌介導的玉米莖尖遺傳轉化及優(yōu)化[J].遼寧大學學報， 2015（42）：186-189.

[11]王宏偉，王宏偉，呂穎穎，等.農桿菌介導法將抗草甘膦基因轉入玉米自交系[J].玉米科學，2013（3）：24-28.

[12]渠柏艷，于海清，韓兆雪，等.可去除選擇標記的轉Bt基因抗蟲玉米研究[J].分子植物育種，2004，2（5）：649-653.

[13]于海清，渠柏艷，付鳳玲，等.可去除選擇標記的轉CpTl基因抗蟲玉米研究[J].玉米科學，2005，13（3）：44-46.

[14]張洪，馬俊，胡國成，等.用葉片檢測轉基因水稻對潮霉素反應的可靠性研究[J].浙江農業(yè)學報，2005，17（6）：341-345.

[15]劉巧泉，陳秀花，王興穩(wěn)，等.一種快速檢測轉基因水稻中潮霉素抗性的簡易方法[J].農業(yè)生物技術學報，2001，9（3）：264.

[16]殷奎德，張興梅，鄭桂萍，等.一種快速檢測轉基因水稻潮霉素抗性標記的方法[J].黑龍江八一農墾大學學報，2010，22（1）：45-48.

[17]康海岐，申國安.水稻愈傷組織對不同培養(yǎng)基的適應性、潮霉素的敏感性及其在遺傳轉化中的利用[J].中國生物工程雜志，2009（10）：50-54.

[18]楊歧生，顏秋生，金小平，等.抗潮霉素B的水稻原生質體的再生[J].浙江大學學報，1996，30（5）：583-588.

[19]李靜雯，張正英，王立光，等.大群體轉基因大麥后代快速篩選研究[J].甘肅農業(yè)科技，2019（8）：12-17.

[20]楚敏，張麗娟，徐建輝，等一種以潮霉素為篩選標記的新疆早熟陸地棉篩選體系的建立[J].新疆農學，2015，52（7）：1285-1291.

[21]趙姝華，張世萍，王富德.玉米、水稻種子及轉Bt基因水稻種子對抗生素的抗性檢測.[J].國外農學-雜糧作物，1997（4）：30-32.

[22]王節(jié)之，郝曉芬，鄭向陽，等.谷子潮霉素抗性濃度的篩選與研究[J].華北農學報，1990，14（4）：60-62.

[23]黃浩，韋瑩，翟勇進，等.黃梁木遺傳轉化受體系統(tǒng)對篩選物敏感性研究[J].四川農業(yè)大學學報，2020，38（1）：58-64.

[24]王哲，孫敬克，王世祥，等.煙草潮霉素抗性濃度的篩選與研究[J].河南城建學院學報，2009，18（4）：65-67.

[25]任永霞，季靜，王罡，等.番茄子葉、莖段及菊花愈傷組織對潮霉素敏感性的研究[J].河北北方學院學報，2006，22（2）：19-33.

[26]王曉春，劉尚前，王罡，等.菊花對潮霉素敏感性研究[J].安徽農業(yè)科學，2008，36（10）：3948-3949.