李慶華 王因花 孔雨光 姚俊修 魯儀增 燕麗萍 吳德軍 任飛 葛文華

摘要：為探索建立紫椴組織培養(yǎng)快速繁育體系，以紫椴種子為材料，探討基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及配比對(duì)紫椴組培快繁效果的影響。結(jié)果表明，增殖培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基最適宜，添加0.05 mg/L 6-BA和0.03 mg/L IBA后，增殖系數(shù)可達(dá)13.5；MS培養(yǎng)基最適宜做壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L6-BA+ 0.1 mg/L IBA+ 0.03 mg/LGA3，平均苗高達(dá)5.15 cm；最佳生根培養(yǎng)基為MS+ 1.0 mg/L6-BA+ 0.05 mg/L NAA，生根率達(dá)93.3%，生根數(shù)達(dá)5.7根。

關(guān)鍵詞：紫椴；組織培養(yǎng)；壯苗培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基；無(wú)性繁殖；快繁技術(shù)

中圖分類號(hào)：S文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas20200200029

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Tilia amurensis LI Qinghua1， WANG Yinhua1， KONG Yuguang2， YAO Junxiu1， LU Yizeng3，

YAN Liping1， WU Dejun1， REN Fei1， GE Wenhua4

（1Shandong Academy of Forestry Sciences/Shandong Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， Shandong， China；2Shandong Territorial and Spatial Planning Institute， Jinan 250014， Shandong， China； 3Shandong Forest Germplasm Resources Center， Jinan 250014， Shandong， China； 4Dashawa Forest Farm of Rizhao， Rizhao 276825， Shandong， China）

Abstract： To explore the establishment of tissue culture and rapid propagation system of Tilia amurensis， the effects of basic medium， plant growth regulator concentration and ratio on tissue culture and rapid propagation of T. amurensis were studied. The results show that 1/2MS medium is the most suitable medium for proliferation， and the proliferation coefficient could reach 13.5 when 0.05 mg/L 6-BA and 0.03 mg/L IBA are added. MS medium is the most suitable medium for strong seedling and rooting， the best medium for strong seedling is MS+ 0.1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L IBA+ 0.03 mg/L GA3， with an average seedling height of 5.15 cm. The best rooting medium is MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA， the rooting rate is 93.3%， and the number of roots is 5.7.

Keywords： Tilia amurensis； Tissue Culture； Medium for Strong Seedling； Medium for Rooting； Vegetative Propagation； Rapid Propagation

0引言

紫椴（Tilia amurensis）是珍貴的闊葉用材樹(shù)種，并于1999年被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)珍貴保護(hù)植物[1]。紫椴樹(shù)姿優(yōu)美，材質(zhì)優(yōu)良，既有很高的觀賞價(jià)值，又是優(yōu)良的用材樹(shù)種；同時(shí)，也是東北地區(qū)主要的蜜源植物，椴樹(shù)蜜質(zhì)量?jī)?yōu)良，在出口蜜中位居榜首[2]。另外，紫椴的花、根等還可入藥[3]。多年來(lái)，由于人們的過(guò)度采伐而又缺乏相應(yīng)的更新保護(hù)措施，使得紫椴這一珍貴樹(shù)種的數(shù)量銳減，為了保護(hù)這一珍貴資源，開(kāi)展高效的繁育方法研究迫在眉睫。

目前，紫椴的繁殖仍以實(shí)生育苗為主，但紫椴種子必須經(jīng)過(guò)一定的特殊處理才能順利萌發(fā)[4-6]，需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且易造成出苗不齊，從而限制了紫椴實(shí)生苗的培育[7]。因此，學(xué)者們紛紛開(kāi)展了紫椴的無(wú)性繁殖研究[8-10]，其中扦插繁殖由于操作簡(jiǎn)單、繁殖速度快而廣受青睞，但扦插繁殖易受季節(jié)、扦插環(huán)境限制，具有一定的局限性，難以滿足紫椴種苗生產(chǎn)的需要。

組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞全能性發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)無(wú)性繁殖技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于木本植物的培養(yǎng)工作中。學(xué)者們也對(duì)椴樹(shù)屬植物的組培快繁工作展開(kāi)了研究。呂校石[11]從外植體消毒、基本培養(yǎng)基選擇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等方面對(duì)紫椴、糠椴、蒙椴等幾個(gè)椴樹(shù)樹(shù)種的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并建立了相應(yīng)的再生體系。王彥彬[12]以4種不同樹(shù)齡紫椴的頂芽、側(cè)芽為材料，對(duì)基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度進(jìn)行了篩選，認(rèn)為只要選擇合適的外源激素，任何培養(yǎng)基均可用于紫椴的組織培養(yǎng)。另有張建瑛等[13]進(jìn)行了紫椴腋芽增殖途徑的組培研究，指出適宜紫椴生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基。目前，有關(guān)紫椴的組織培養(yǎng)技術(shù)還不成熟，研究結(jié)果未得到較為一致的結(jié)論，還未形成成熟的技術(shù)體系。本研究在已有的基礎(chǔ)上，就紫椴無(wú)菌苗培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等方面進(jìn)行一系列研究，旨在為其工廠化育苗提供一定的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紫椴（Tilia Amurensis）種子，采自濟(jì)南市泉城公園，母樹(shù)年齡20年，千粒重44.3 g。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無(wú)菌苗培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基質(zhì)處理。以普通河沙代替MS培養(yǎng)基，將河沙加水拌濕，濕度保持在65%左右；將濕沙分裝在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行高壓滅菌，121℃、0.12 MPa/cm2下滅菌20 min。

（2）種子處理。將種子放入無(wú)菌瓶中，倒入濃硫酸（濃硫酸的用量以沒(méi)過(guò)種子為宜）處理10～20 min，期間不斷用玻璃棒進(jìn)行攪拌；倒掉濃硫酸，用無(wú)菌水沖洗種子數(shù)次，直至將濃硫酸殘留沖洗干凈；將種子用0.1%的升汞溶液浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗5次；用無(wú)菌的500 mg/L GA3溶液浸泡種子6 h（種子處理過(guò)程均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行）。

（3）無(wú)菌材料的獲得。在無(wú)菌操作臺(tái)上，將處理后的種子放入步驟1.2.1（1）所述濕沙中，每瓶放入20粒左右，之后將培養(yǎng)瓶置于0～4℃環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)（有無(wú)光照條件均可），20天左右有90%以上的種子裂口（部分種子已萌發(fā)出胚根），此時(shí)將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到組培室內(nèi)（白天溫度（25±2）℃，夜間溫度（18±2）℃），3～5天種子即可萌發(fā)。

1.2.2增殖培養(yǎng)采用正交試驗(yàn)方法，分別對(duì)基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度進(jìn)行研究?；九囵B(yǎng)基采用MS、1/2MS和WPM 3種，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用6-BA、IBA。將獲得的無(wú)菌苗剪成1～2 cm的帶芽莖段接于各培養(yǎng)基上，每處理接種3瓶，每瓶接種5個(gè)莖段，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)[式（1）]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.3壯苗培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，選用IBA、6-BA和GA33種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（表2），每種培養(yǎng)基接種3瓶，每瓶接種5個(gè)莖段，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)平均苗高。

1.2.4生根培養(yǎng)待試管苗苗高達(dá)3 cm左右時(shí)，將其接種于MS培養(yǎng)基上，并添加不同濃度的IBA和NAA（表3），每種培養(yǎng)基接種3瓶，每瓶5棵。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20. 0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，Excel 2010制圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對(duì)紫椴試管苗增殖的影響

各處理下紫椴試管苗的增殖情況見(jiàn)表4～5。在9種不同的處理中，增殖系數(shù)差異達(dá)到顯著水平（P< 0.05），用其中基本培養(yǎng)基為1/2MS的3個(gè)處理（A4、 A5、A6）的增殖系數(shù)最為理想，其中A5處理的增殖系數(shù)最高，為13.5，其次為A4處理，增殖系數(shù)為11.5，A6處理的增殖系數(shù)為9.5；基本培養(yǎng)基為MS的3個(gè)處理（A1、A2、A3）增殖系數(shù)居中；基本培養(yǎng)基為WPM的3個(gè)處理（A7、A8、A9）的增殖系數(shù)均較低。在3種不同的基本培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基上的試管苗平均增殖系數(shù)為6.2，1/2MS培養(yǎng)基上的平均增殖系數(shù)為11.5，而WPM培養(yǎng)基上的平均增殖系數(shù)最低，僅為2.7。對(duì)各因素進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基的極差最大（R=8.8），說(shuō)明培養(yǎng)基類型對(duì)紫椴的增殖培養(yǎng)影響最大。方差分析表明，培養(yǎng)基類型對(duì)增殖系數(shù)的影響達(dá)到顯著水平，而6-BA與IBA在本研究設(shè)定的濃度范圍內(nèi)對(duì)增殖系數(shù)的影響均不顯著（表5）。3個(gè)因素的最佳水平組合為A5處理（1/2MS+ 0.1 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L IBA），其增殖系數(shù)最高，為紫椴增殖培養(yǎng)的最佳配方，其次為A4和A6處理。

2.2植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫椴試管苗壯苗的影響

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在增殖培養(yǎng)階段，僅添加6-BA和IBA的培養(yǎng)基雖然大大提高了紫椴的增殖效果，但芽體生長(zhǎng)情況較差，不抽莖，矮小，故在配方中添加不同濃度的GA3來(lái)促進(jìn)芽體的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。結(jié)果（表6）表明，添加GA3以后紫椴芽體伸長(zhǎng)生長(zhǎng)效果明顯，其中B2處理的生長(zhǎng)情況最好，試管苗生長(zhǎng)迅速，葉片大而綠，培養(yǎng)30天苗高可達(dá)5.75 cm；其次為B4和B1處理，平均苗高為4.78、4.77 cm。極差分析表明，3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中極差最大的因素為GA3，對(duì)紫椴試管苗苗高的影響最大。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表7）表明，GA3和IBA對(duì)苗高的影響均達(dá)到顯著水平，而6-BA對(duì)苗高的影響不明顯。3個(gè)因素的最佳組合為B2，即0.05 mg/L 6-BA+ 0.03 mg/L IBA+ 0.03 mg/LGA3。

2.3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫椴試管苗生根的影響

當(dāng)試管苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)入添加了不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中，以不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基為對(duì)照。結(jié)果（表8）表明，在不同濃度的IBA與NAA組合中，紫椴試管苗的生根率差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。在9個(gè)處理中，C5處理的生根率最高，達(dá)93.3%，且其生根數(shù)量也最多的，平均生根數(shù)量為5.7根，對(duì)照生根率為0。

3結(jié)論與討論

選擇適宜的培養(yǎng)基是做好組織培養(yǎng)工作的第一步，植物種類不同，適應(yīng)的培養(yǎng)基也不盡相同。在石仙桃的組織培養(yǎng)研究中，最適宜其種子萌發(fā)和原球莖誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，適合其假鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基則為1/2MS培養(yǎng)基[14]；興安杜鵑最適宜的培養(yǎng)基則為WPM培養(yǎng)基，其在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體幾乎全部死亡[15]；而適宜楸樹(shù)增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基這是DKW培養(yǎng)基[16]。在椴樹(shù)屬植物的組織培養(yǎng)工作中，人們也對(duì)基本培養(yǎng)基進(jìn)行了研究與篩選。劉芳[17]對(duì)南京椴組織培養(yǎng)技術(shù)的研究指出，MS培養(yǎng)基適合南京椴的不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)，這與湯詩(shī)杰[18]的研究結(jié)論較為一致。在對(duì)紫椴的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究的過(guò)程中，WPM被認(rèn)為是比較適合于紫椴腋芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基[11-13]，但在本研究中卻發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基更適合紫椴試管苗的增殖培養(yǎng)，WPM培養(yǎng)基的增殖效果最差，因此選擇1/2MS培養(yǎng)基為紫椴增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，而MS培養(yǎng)基則更適用于紫椴的壯苗培養(yǎng)。

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素常被組合應(yīng)用到植物的組織培養(yǎng)工作中。其中6-BA可顯著促進(jìn)芽的形成，其與低濃度的生長(zhǎng)素配合使用更有利于增殖[19]。將一定濃度的6-BA、NAA和IAA配合添加到改良MS培養(yǎng)基上，可使紫霞黃櫨的增殖系數(shù)達(dá)8.97[20]；6-BA與KT和IBA協(xié)同作用最有利于四藥門花的增殖培養(yǎng)[21]；6-BA與NAA配合使用也可使小濱菊和簸箕柳獲得良好的增殖效果[22- 23]。本研究中，1/2M培養(yǎng)基中添加0.05～ 0.2 mg/L 6-BA，配合使用0.01～0.05 mg/L IBA，可有效促進(jìn)紫椴試管苗的增殖生長(zhǎng)，增殖系數(shù)可達(dá)13.5。

赤霉素（GA3）常被用于組培苗的增殖和生長(zhǎng)[24]，其生理作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)，從而引起莖稈伸長(zhǎng)和植物增高[18]。與細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配合使用，可有效促進(jìn)組培苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[25]。本研究中，GA3在紫椴組織培養(yǎng)中起著非常重要的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中只添加6-BA和IBA時(shí)，紫椴試管苗只進(jìn)行增殖而不進(jìn)行增高生長(zhǎng)，添加適當(dāng)濃度的GA3可顯著促進(jìn)試管苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，從而順利得到了優(yōu)質(zhì)的紫椴組培苗，這與湯詩(shī)杰等[18]在南京椴的研究中得出的結(jié)論一致。

本研究以紫椴種子為材料，初步建立了一套無(wú)菌苗培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的技術(shù)體系，其中，增殖培養(yǎng)基以1/2MS+0.05mg/L6-BA+0.03 mg/L IBA最適宜，增殖系數(shù)為13.5，最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+ 0.1 mg/L6-BA+ 0.1 mg/L IBA+ 0.03 mg/LGA3，平均苗高達(dá)5.15 cm，最佳生根培養(yǎng)基為MS+ 1.0 mg/L6-BA+ 0.05 mg/L NAA，生根率達(dá)93.3%，生根數(shù)達(dá)5.7根。但本研究但尚未找到可同時(shí)滿足紫椴增殖生長(zhǎng)與增高生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基，這是下一步繼續(xù)研究的方向，以盡快建立成熟的紫椴組織培養(yǎng)技術(shù)體系。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家林業(yè)局，農(nóng)業(yè)部.國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）[Z].北京，1999.

[2]諸葛仁，唐亞.椴樹(shù)屬形態(tài)演化與生物地理學(xué)[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)， 1995，15（4）：1-14.

[3]史鋒厚，盧芳，沈永寶，等.椴樹(shù)屬植物研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā)， 2006，20（1）：12-15.

[4]鄭金輝，林士杰，張艷敏，等.NaOH處理對(duì)紫椴種子休眠解除及生理生化特性的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（16）：35-40.

[5]楊立學(xué)，王海南，范晶，等.解除紫椴種子休眠技術(shù)的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（6）：130-134.

[6]王海南.紫椴種子休眠機(jī)理及休眠解除技術(shù)的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[7]羅麗芬，王鳳霞，趙墾田，等.紫椴種子快速催芽育苗試驗(yàn)研究[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，18（2）：103-108.

[8]姚盛智，陳志成，王冰.紫椴嫁接技術(shù)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992（6）：22-27.

[9]張有富，陳文山，劉高義，等.紫椴硬枝扦插技術(shù)[J].吉林林業(yè)科技， 2002（2）：12-13.

[10]王海南，沈海龍，楊立學(xué).紫椴嫩枝扦插繁殖技術(shù)研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究.2012，30（3）：106-110.

[11]呂校石.椴樹(shù)組織培養(yǎng)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[12]王彥彬，頡玉敏，陳榮，等.紫椴的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].防護(hù)林科技，2002（2）：37-38，46.

[13]張建瑛，呂躍東，李京，等.紫椴腋芽增殖途徑快繁的影響因子分析研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（11）：23-26.

[14]吳宇函，俞涵曦，李靜，等.不同培養(yǎng)基對(duì)石仙桃種子萌發(fā)的影響[J].農(nóng)業(yè)工程，2019，9（3）：107-111.

[15]杜鳳國(guó)，呂偉偉，王歡，等.興安杜鵑基本培養(yǎng)基和外殖體選擇的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（12）：136-138.

[16]孟路，劉勇，賀國(guó)鑫，等.楸樹(shù)優(yōu)良品種‘朝霞’增殖及生根培養(yǎng)的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，34（1）：119-123，156.

[17]劉芳.南京椴組織培養(yǎng)的研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2007.

[18]湯詩(shī)杰，李乃偉，湯庚國(guó).南京椴組織培養(yǎng)快繁體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（6）：87-89.

[19]臧文靜，陳瑩，李青，等.雜交狼尾草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)[J].草業(yè)科學(xué)，2015，32（9）：1451-1456.

[20]吳凡，趙蓓蓓，王浩，等.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫霞黃櫨組織培養(yǎng)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（15）：2942-2946，2958.

[21]孟路，劉勇，賀國(guó)鑫，等.楸樹(shù)優(yōu)良品種‘朝霞’增殖及生根培養(yǎng)的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，34（1）：119-123，156.

[22]邵冰潔，劉文竹，許建新，等.小濱菊組培快繁體系的初步建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，35（2）：62-67.

[23]孫永蓮，戴曉港，李小平，等.簸箕柳組培再生體系的建立[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2019，43（2）：31-37.

[24]付曉佳.二倍體半枝蓮愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)研究[D].南京：南京師范大學(xué)，2016.

[25]劉靜.非洲菊組培苗繼代增殖與液體生根的研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.